龙眼多糖的结构表征及其免疫调节活性研究

为明确龙眼活性多糖的组成与结构,揭示干、鲜龙眼活性多糖组成与免疫调节活性的差异,本文从干制和新鲜龙眼中分离纯化获得6个均一组分多糖；采用红外光谱(IR)、排阻层析-激光光散射(SEC-LLS)、气相色谱(GC)、核磁共振(NMR)等手段对多糖的结构进行了表征;分析了干、鲜龙眼主活性多糖对巨噬细胞吞噬活性、相关细胞因子分泌和脾淋巴细胞增殖的影响,探讨了干、鲜龙眼多糖免疫调节活性差异的基础,主要研究结果如下：1.确定了龙眼多糖脱色除蛋白的工艺条件分析比较了7种树脂对龙眼粗多糖溶液脱色除蛋白的效果,确定D301-R大孔树脂为龙眼粗多糖脱色除蛋白的最优树脂。优化建立了D301-R脱色除蛋白的工艺条件：料液比0.61g：1mL,温度48℃,时间2.0h,pH5.0。在此工艺条件下,D301-R对龙眼粗多糖的脱色率为75.32%,蛋白去除率为91.83%,多糖保留率为93.37%。2.纯化获得6个均一组分多糖比较了DEAE-FF和Q-FF离子交换树脂对龙眼多糖的分离效果,确定了DEAE-FF分离龙眼多糖的离子层析条件。采用G4000PWxl串联G3000PWxl凝胶色谱对离子层析获得的多糖进行分离纯化,制备获得干制龙眼中性多糖LPgl(16.41min),酸性多糖LPg2(25.23min);新鲜龙眼中性多糖LPxl(16.08min)、 LPx2 (17.75min)和酸性多糖LPx3 (20.83min)、LPx4 (27.10min)共6个均一组分多糖。3.对龙眼多糖的结构进行了解析采用SEC-LLS、IR、GC、NMR等手段对纯化获得的5种主多糖组分的结构进行了解析。确定LPgl是由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(相对摩尔比0.2：0.21：1：0.2)组成的(Mw=1.06×107Da; Rz=51.7nm)具有乙酰基结构的a型多糖；LPx1是由甘露糖和葡萄糖(相对摩尔比0.59：1)组成的(Mw=1.31×107Da; Rz=50.3nm) α型多糖；LPx3是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(相对摩尔比0.09：0.18：1.15：1：0.51)组成的(Mw=1.85×106Da; Rz=53.1nm)具乙酰基结构的β型多糖；LPg2是由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(相对摩尔比0.25：0.49：1：0.5)组成(Mw=9.64x 106Da; Rz=54.0nm)的β构型吡喃糖；LPx4是由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸(相对摩尔比0.05：0.07：0.12：0.14：1.16：1：0.22：0.32：0.1)组成的(Mw=6.31×104Da; Rz=100.6nm)具有α构型的呋喃糖。4.比较了干制和新鲜龙眼主活性多糖的免疫调节活性结果显示,在12.5～100μg/mL浓度范围,干、鲜龙眼多糖均能够不同程度的增强巨噬细胞吞噬活性。相对于鲜龙眼多糖,干制龙眼多糖在低浓度(12.5-25μg/mL)表现出较高的增强巨噬细胞吞噬活性的作用,并具有更强的诱导巨噬细胞NO、IL-1β、IFN-γ等Th-1型细胞因子分泌的作用。干、鲜龙眼多糖在12.5-50μg/mL浓度范围,具有剂量依赖性的促进脾淋巴细胞增殖的作用,干制龙眼多糖表现出更强的(p<0.05)促进作用；在25～100μg/mL浓度范围,干、鲜龙眼多糖均能显著抑制LPS诱导的脾淋巴细胞增殖,干制龙眼多糖表现出更强的(p<0.05)抑制LPS诱导的细胞增殖活性。综合上述结果表明,相对于鲜龙眼多糖,干制龙眼多糖具有较强的调节巨噬细胞和脾淋巴细胞的活性。本文对干制和新鲜龙眼活性多糖组成、结构与活性差异的研究,可以为揭示龙眼干药用保健功效的物质基础,明确龙眼多糖的结构和其免疫调节活性的关系,促进龙眼精深加工提供基础。