苹果MdFKs基因的表达分析与原核表达

糖是果实品质的主要组成,其中果糖是最甜的可溶性糖,它是苹果中糖的主要组成成分。果糖在果实细胞中的积累和代谢受果糖激酶(FK)的高度调控。本论文分析了苹果基因组中果糖激酶(MdFK)基因家族的相关信息,研究了它们在苹果中的表达特性与糖积累和利用的关系,并通过原核表达对它们的蛋白特性进行分析,取得的结果如下:1.在苹果基因组中克隆了4个果糖激酶基因,并与番茄和拟南芥的果糖激酶家族高度同源。MdFK1和MdFK4长均为1077 bp,二者的氨基酸同源性高92.5%,但在碱基序列上二者分别与番茄LeFK1(AAB57733)和LeFK4同源。MdFK2长990bp,与LeFK2(AAB57734)同源,氨基酸同源性为80.9%。2.qRT-PCR分析发现:它们均在苹果中表达,其中MdFK2表达丰度最高,且主要在茎尖和幼果中表达,具有库特异性,MdFK1在成熟叶片和果实中表达较高。同时,通过对山梨醇含量降低的苹果茎尖糖代谢相关基因的表达分析及其对外源山梨醇和蔗糖响应的研究发现,MdFK1和MdFK4转录水平受山梨醇和果糖含量的调控,即山梨醇合成的降低引起了MdFK1和MdFK4表达的下降,而山梨醇饲喂增加了二者的表达。山梨醇含量的降低诱导了MdFK2表达的增加,这可能与不同MdFK成员编码蛋白质的亲和性及果糖信号在库器官糖稳态中的重要性有关。3.洋葱表皮细胞亚细胞定位试验表明:MdFK1主要定位于质膜及细胞质,MdFK2定位于整个细胞内,而MdFK3定位于质膜和细胞核,同时存在于一个叶绿体的穿梭保守区,可能编码一个质体蛋白。4.MdFK基因的原核表达及蛋白的可溶性诱导及纯化:构建了重组表达载体pGEX-4T-1/FK,表达产物经SDS-PAGE验证,获得与预期相符的50 kD的重组蛋白。但诱导的蛋白主要以包涵体形式存在,我们重新构建了pSUMO-MdFK2载体,由于SUMO tag的帮助,MdFK2在BL21(DE3)中成功表达并经一步Ni柱纯化得到高质量的MdFK2蛋白。