川芎嗪诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的信号转导机制

本研究利用中药川芎嗪（Tetramethylpyrazine, TMP）单体诱导小鼠骨髓间充质干细胞系（D1细胞, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）,探讨了川芎嗪体外对小鼠BMSCs分化为神经细胞的影响及信号转导的分子机制。 实验分为3组:川芎嗪诱导组（含2.4 g/L川芎嗪）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol, BME）阳性对照组和阴性对照组（未诱导的BMSCs）。各组进行同步实验,运用RT-PCR技术检测神经干细胞巢蛋白（nestin）基因、未成熟神经元β-微管蛋白III （β-Tubulin III）基因、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）基因和核受体相关因子1（nuclear receptor relatedfactor 1, Nurr1）基因及神经胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）基因的表达,荧光免疫化学和Western blot方法检测nestin和NSE蛋白的表达。 利用EGTA(细胞外Ca2+螯合剂)、Nifedipine(细胞膜L-型Ca2+通道阻断剂)和LY294002（PI3K信号通路阻断剂）分别或同时阻断细胞不同的Ca2+途径,运用PD98059阻断MEK-ERK信号通路、SB203580阻断p38MAPK信号通路、PD98059和LY294002同时阻断MEK-ERK和PI3K信号通路、SB203580和LY294002同时阻断p38MAPK和PI3K信号通路,阻断的同时用川芎嗪诱导BMSCs,运用RT-PCR和Western blot方法检测阻断前后,川芎嗪诱导BMSCs神经定向分化中NSE、Nurr1 mRNA及NSE蛋白的表达变化,探讨细胞不同Ca2+信号、MEK-ERK和p38MAPK信号转导通路对川芎嗪诱导BMSCs的神经定向分化的作用。 结果表明,川芎嗪诱导BMSCs后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞,且诱导时细胞死亡率低于BME阳性对照组。免疫荧光化学和Western blot结果显示,川芎嗪诱导后的细胞nestin和NSE蛋白表达呈阳性,表达丰度显著高于阳性对照组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl,表明川芎嗪能定向诱导小鼠BMSCs分化为神经元样细胞,是较理想的神经诱导剂。与对照组相比,单独或同时阻断细胞外Ca2+、细胞膜L-型Ca2+通道和PI3K信号通路后,对川芎嗪诱导BMSCs的神经分化具有协同促进功能;胞外过量的Ca2+,对川芎嗪诱导BMSCs的神经定向分化具有抑制作用;阻断MEK-ERK、p38MAPK信号通路、同时阻断MEK-ERK和PI3K信号通路及p38MAPK和PI3K信号通路时,抑制川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的定向分化。 因此,川芎嗪通过不同的Ca2+信号途径、MEK-ERK及p38MAPK信号转导通路调节川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的定向分化。