具有益生功能的Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9的安全性评估、生理功效及其全基因组学研究

Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9是从12位健康蒙古族儿童粪便分离得到的31株双歧杆菌中筛选出的1株具有良好益生功能的新型潜在益生菌。为了将其更好地应用到食品工业生产中,本研究对B.animalis subsp. lactis V9的抗生素抗性、质粒、相关抗性基因,及其安全性毒理学进行了检测。利用B.animalis subsp. lactis V9冻干菌粉临床治疗便秘和腹泻患者,并对其生理功效进行观察。此外,对B.animalis subsp. lactis V9全基因组序列进行测序,从基因组水平解析菌株遗传背景,并为该菌株生产提供指导依据。 通过检测B. animalis subsp. lactis V9对12种常见抗生素的最低抑制浓度可知,B. animalis subsp. lactis V9对庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素B表现出很强耐受性;对新霉素、环丙沙星和链霉素表现出较强耐受性;对四环素和氯霉素表现出一定耐受性;不可耐受万古霉素、青霉素、利福平及红霉素。与商业益生菌B. animalis subsp. lactis BB12相比,B. animalis subsp. lactis V9的抗生素抗性较弱。在B. animalis subsp. lactis V9中没有检测到质粒的存在。对其相关耐药基因的检测表明,B. animalis subsp. lactis V9的染色体中含有与四环素抗性相关的rpp基因和与氟喹诺酮类抗生素(如环丙沙星)相关的抗性基因gyrA。由于这些抗性基因在染色体上存在,不可转移。因此,从抗生素抗性角度来看,B. animalis subsp. lactis V9是安全的。 通过动物实验对B. animalis subsp. lactis V9冻干菌粉进行安全性毒理学评价。连续14天对小鼠灌胃不同剂量的B. animalis subsp. lactis V9冻干菌粉(0.5、5、15g/kg体重),测定小鼠体重变化、生长状况及血液细胞成分、肝脏功能、脏器指数变化、脂类代谢情况等指标。同时利用显微镜观察不同剂量组灌胃小鼠的肝、肾形态学。其结果显示,B. animalis subsp. lactis V9对小鼠的半数致死量(LD50)为15 g/kg体重(约为2.25×1012 cfu/kg体重)。灌胃14d后,小鼠未出现中毒症状,更无死亡现象,该菌株对小鼠的生长发育无不良影响。小鼠体重变化与对照组相比无显著差异(P>0.05)。血常规、肝功能、脏器指数、血清脂类等各项指标测定结果与对照组相比无显著差异(P>0.05)。此外,通过对小鼠肝脏、肾脏的染色镜检可知,灌胃冻干菌粉的小鼠的肝脏、肾脏均无异常改变。因此,B. animalis subsp. lactis V9无毒副作用。 在以上安全性评估实验的基础上,利用B. animalis subsp. lactis V9菌粉治疗153例便秘及腹泻患者(剂量为1.0×1010 cfu/d),检测其生理功效。实验结果表明:连续服用B. animalis subsp. lactis V9冻干粉21天后,该菌粉对于便秘、急性腹泻、慢性腹泻患者的治愈率分别为95.3%、95.4%、89.9%。治疗效果随患者年龄的增大而减弱。服用B.animalis subsp. lactis V9冻干菌粉可有效改善肠道菌群,及时控制腹泻。由以上结果可知,B.animalis subsp. lactis V9对便秘和腹泻的治疗效果主要体现在提高肠道内双歧杆菌数量,调节肠道菌群平衡,从而发挥其独特的益生作用。以B.animalis subsp. lactis V9治疗便秘和腹泻具有安全、显效的优点,能够从根本上缓解并治疗便秘和腹泻。 为了深入系统的了解B. animalis subsp. lactis V9益生特性的遗传基础,本研究采用Roche 454高通量测序构建全基因组草图与Illumina Solexa高通量测序补充数据和纠错相结合的方法,测定了该菌株的全基因组序列并进行了比较基因组分析。B. animalis subsp. lactis V9染色体基因组为环状分子,平均G+C含量为60.5%,染色体的长度为1,944,050 bp,分析得到了1,636个开放阅读框(ORF),其中1,572个编码区(CDSs)可以被赋予潜在的生物学功能。此外,该菌染色体还包含4个rRNA操纵子和52个tRNA基因。比较基因组学研究表明,动物双歧杆菌乳酸亚种菌株遗传极为稳定,在菌株传代保藏过程中发生重组、突变几率极小。并从基因组角度解析了双歧杆菌具有强的低聚糖代谢能力以及在微厌氧环境可继续生长的原因。