降钙素基因相关肽对大鼠骨髓源性巨噬细胞破骨分化和骨吸收功能影响的实验研究

在临床上我们发现中枢神经系统损伤(如截瘫或者颅脑损伤)的患者若同时伴有四肢长骨骨折时,常常在骨折区出现大量骨痂的过度生长,严重的甚至出现异位骨化,其骨折愈合的速度也快于不伴中枢神经系统受损的四肢长骨骨折患者;相反的若是骨折患者同时伴有明显周围神经损伤时,骨折愈合的过程将出现明显的延长,延迟愈合甚至是骨不愈合的可能增高。大量文献表明中枢神经受到损伤后,神经肽类物质在外周血液中的浓度升高,这可能是导致骨痂过度生长的重要原因;这些神经肽类物质其中就包括降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质等。降钙素基因相关肽(CGRP)是一种体内广泛分布的神经肽,研究发现其具有促成骨的作用,但是CGRP对骨吸收中破骨前体细胞即骨髓源性巨噬细胞(BMMs)的是否具有调控作用尚不清楚。因此我们课题组设计了相应实验,来探究CGRP对SD大鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)破骨分化和骨吸收功能的影响,阐明其影响骨代谢的分子机制,为骨修复和骨重建提供新的思路。实验一降钙素基因相关肽对大鼠骨髓源性巨噬细胞破骨分化的影响目的:研究降钙素基因相关肽对大鼠骨髓源性巨噬细胞破骨分化的影响。方法:(1)采用差速贴壁的方法分离出SD大鼠骨髓源性巨噬细胞,原代培养并传代,而后加入适当浓度的s RANKL和M-CSF,进行大鼠破骨前体细胞的破骨分化诱导。(2)实验分组:A:空白对照组(不含CGRP);B:高剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-7mol/L);C:中剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-8mol/L);D:低剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-9mol/L)。(3)加入不同浓度CGRP后破骨分化诱导培养7天,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(TRAP染色)观察破骨细胞形态并对成熟的破骨细胞进行计数分析。(4)加入不同浓度CGRP后破骨分化诱导7天,通过RT-PCR方法检测破骨分化特异性特基因(RANK、TRAP、NFATc1)m RNA的表达。(5)对加入不同浓度CGRP破骨分化诱导7天后的破骨细胞进行处理,通过Western-blot检测破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表达。结果:(1)TRAP染色显示,相对于空白对照组不同浓度CGPR处理组的成熟破骨细胞数目显著减少,有统计学差异(P<0.05)并且随CGRP浓度的增高成熟破骨细胞数减少(P<0.05),组间亦有明显差异(P<0.05)。(2)RT-PCR检测破骨分化特异性特基因RANK、TRAP、NFATc1 m RNA和Western-blot测破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表达,结果提示不同浓度CGRP组均明显低于空白对照组,具有统计学差异(P<0.05)。结论:本实验通过体外骨髓源性巨噬细胞诱导培养破骨细胞的方法,观察到CGRP具有抑制破骨前体细胞破骨分化的作用,提示CGRP在骨修复及骨重建中可能发挥重要的作用。实验二降钙素基因相关肽对大鼠骨髓源性巨噬细胞破骨诱导后骨吸收功能的影响目的:研究降钙素基因相关肽对大鼠骨髓源性巨噬细胞破骨诱导后骨吸收功能的影响。方法:(1)采用差速贴壁的方法分离出SD大鼠骨髓源性巨噬细胞,原代培养并传代,而后加入适当浓度的s RANKL和M-CSF,进行大鼠破骨前体细胞的破骨分化诱导。(2)实验分组:A:空白对照组(不含CGRP);B:高剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-7mol/L);C:中剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-8mol/L);D:低剂量CGRP处理组(CGRP浓度为10-9mol/L)。(3)用不含CGRP的破骨诱导液培养骨髓源性巨噬细胞7天后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(TRAP染色)观察破骨细胞形态,并对破骨细胞进行鉴别。(4)在不同时间点,通过WST-1法检测不同浓度CGRP对大鼠破骨前体细胞BMMs增殖率的影响。(5)加入不同浓度CGRP后将破骨前体细胞BMMs破骨分化诱导7天,通过RT-PCR检测破骨细胞骨吸收功能性基因MMP-9、Cathepsin K m RNA的表达。(6)将BMMs接种于骨磨片上,用含有不同浓度CGRP的破骨诱导液诱导7天后,对骨磨片行甲苯胺蓝染色检测CGRP对破骨细胞的骨吸收功能的影响。结果:(1)与空白对照组相比,各CGRP处理组对破骨前体细胞BMMs的增殖具有抑制作用,且随着CGRP浓度的升高,抑制作用更加明显。(2)RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,CGRP处理组明显抑制破骨相关酶MMP-9和Cathepsin K m RNA的表达。(3)甲苯胺蓝骨磨片染色显示,与空白对照组相比,CGRP处理组的骨陷窝数目明显减少,具有统计学差异(P<0.05),且CGRP处理组浓度与陷窝数量呈负相关性。结论:本实验通过体外骨髓源性巨噬细胞诱导培养破骨细胞的方法,观察到CGRP具有抑制破骨前体细胞增殖以及抑制骨吸收功能的作用,为CGRP临床治疗骨折提供了重要的理论依据。