滋阴中药活性成分对神经退行性疾病的神经保护作用及机制研究

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是好发于老年人最常见的神经退行性疾病。AD主要病理特征是基底核胆碱能神经元变性丢失,PD则是黑质多巴胺能神经元的退行性变性丢失等。神经营养因子,特别是脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对于神经元的存活、生长发育具有重要作用。开发诱导内源性BDNF/GDNF表达的小分子化合物已成为神经退行性疾病药物治疗的一个研究热点。因此,本课题主要研究滋阴中药活性成分哈巴俄苷(harpagoside,HAR)和异菝葜皂苷元(Smilagenin,SMI)在神经退行性疾病中的作用,探讨是否与诱导BDNF/GDNF蛋白表达有关,从而阐明他们改善神经退行性疾病的共性。第一部分实验,通过构建拟AD模型,从在体和离体两个层面研究HAR对拟AD模型的神经保护作用,并对相关机制进行探讨。在体实验,通过双侧海马立体定位注射Aβ1-40,构建拟AD大鼠模型。喂服HAR 60天后,首先进行相关行为学测试,用旷场试验评价大鼠运动功能,新物体识别实验和Y-迷宫实验评价学习记忆功能。行为学分析显示,与假手术对照组相比,Aβ损伤的模型组大鼠学习记忆功能明显下降;HAR治疗能够改善其学习记忆功能;各组大鼠的运动功能没有差异。接着用ELISA和Western blot方法观察HAR对BDNF及其信号转导通路相关蛋白的影响。结果发现HAR能够上调模型大鼠内嗅皮层、海马组织下降的BDNF蛋白表达,提高其皮层、海马组织p-ERK与ERK、p-AKT与AKT的比值。提示HAR能够诱导BDNF蛋白表达以及激活ERK、AKT信号转导通路。最后观察HAR对突触蛋白的影响,结果发现突触蛋白含量在各组大鼠皮层、海马组织中均无明显差异。离体实验,采用Aβ1-42损伤原代皮层神经元作为拟AD细胞模型。首先,研究HAR对皮层神经元的保护作用。结果显示HAR预保护24h能剂量依赖性的提高A?损伤细胞的存活率(MTT分析),提高ChAT阳性神经元的数目及轴突长度(免疫细胞化学分析)。提示HAR能够保护胆碱能神经元免于Aβ损伤。Western blot结果显示HAR提高Aβ损伤组p-ERK/ERK、p-AKT/AKT的值。最后,对HAR的机制进行研究。阻断BDNF后,发现HAR提高A?损伤细胞存活率的能力以及保护ChAT阳性神经元的作用被全部或者部分抑制,提示HAR发挥保护作用的机制可能是通过上调BDNF蛋白表达实现的。前期研究发现SMI对老年大鼠学习记忆功能有影响,第二部分实验主要研究SMI对老年大鼠多巴胺能神经系统退行性改变和运动功能的影响。以青年和老年大鼠为研究对象,老年大鼠给予灌胃SMI 60天后能够显著改善老年大鼠的运动功能(旷场试验和Rotarod行为学测试)、增加黑质致密部酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目(免疫组织化学染色和立体计数)、提高纹状体多巴胺转运体密度(放射自显影测定)和脑内多巴胺受体(D1、D2R)密度(放射配基结合分析)。同时,SMI能提高老年大鼠下降的GDNF蛋白含量(ELISA)。综上所述,我们首次证实HAR可能通过上调BDNF蛋白表达及激活下游MAPK/PI3K信号转导通路,促进胆碱能神经元的存活及轴突生长,从而改善拟AD模型大鼠的学习记忆功能。本研究还发现SMI可能是通过上调GDNF蛋白表达,保护老年大鼠中脑多巴胺能神经元退行性改变,从而改善老年大鼠的运动功能障碍。提示这些滋阴药可能是通过诱导多种内源性神经营养因子表达,保护特定神经元退行性病变,可能会延缓神经退行性疾病的进程,这为开发治疗神经退行性疾病的新药提供了科学的实验基础和理论依据。