熊果酸对肝星状细胞Hedgehog信号通路的影响

背景： 各种原因导致慢性肝损伤可造成肝脏纤维化，甚至发展成为肝硬化。静止型肝星状细胞(Quiescent hepatic stellate cells,Q-HSCs)的活化、增殖并转化为肌纤维细胞样肝星状细胞（Muscle into fibrous hepatic stellate cells,MF-HSCs）是肝纤维化的发生、发展的中心事件。Hedgehog（Hh）信号通路在肝脏损伤修复过程中发挥着重要作用,特别是介导MF-HSCs的活化、增殖。有文献表明，在HSCs活化、增殖过程中，Hh信号通路组成分子Hh配体[Sonic hedgehog (Shh),Deserthedgehog (Dhh),Indian hedgehog (Ihh)]、受体蛋白Patched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)及锌指转录因子（Glioblastoma1/2，Gli1/2）表达是上调的，而Hh配体相互作用蛋白(Hh interacting protein，Hhip)表达下调。新近研究发现NOX参与对Hh信号通路的调控，NOX亚基Rac1能激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MF-HSCs转化。而我们前期研究发现熊果酸能显著抑制瘦素诱导的NOX亚基p22Phox和Rac1mRNA的表达。本研究将基于前期的研究结果，进一步观察熊果酸对瘦素诱导的Hh信号通路的影响。 目的： 探索熊果酸对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）Hh信号通路的影响及机制。 方法： 将处于对数生长期的HSC-T6细胞分为6组：正常对照组；瘦素组（100ng/ml）；熊果酸（50μM）；DPI组（20μM）；熊果酸干预组（瘦素+熊果酸50μM）；DPI干预组（瘦素+DPI20μM）。在药物作用12h后，提取总RNA，采用RT-PCR法检测Shh、smo、Gli1/2的表达；药物作用HSC-T6细胞24小时后，提取总蛋白，采用Western blotting分别检测Rac1和Gli2的表达；药物作用12h、24h及48h后，采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖情况。 结果： 1．熊果酸对HSC-T6细胞Shh mRNA表达的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Shh mRNA表达较正常对照组升高，但差异无统计学意见（P>0.05）；熊果酸干预后Shh mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P<0.05）；DPI干预组Shh mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P<0.01）。上述结果表明熊果酸、DPI均能下调瘦素介导的HSC-T6细胞ShhmRNA的表达，而且DPI的抑制作用强于熊果酸。 2．熊果酸对HSC-T6细胞Smo mRNA表达的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Smo mRNA表达较正常对照组升高（P<0.05）；熊果酸干预后Smo mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（P<0.01）；DPI干预组Smo mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（P<0.01）。上述结果表明熊果酸、DPI均能下调瘦素介导的HSC-T6细胞Smo mRNA的表达。 3．熊果酸对HSC-T6细胞Gli1mRNA表达的影响 各组干预12h后HSC-T6细胞Gli1mRNA表达无明显的统计学意义。因此，瘦素对HSC-T6细胞Gli1mRNA的表达无影响，而熊果酸及DPI干预也不影响HSC-T6细胞Gli1mRNA的表达。 4.熊果酸对HSC-T6细胞Gli2mRNA表达的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Gli2mRNA表达较正常对照组升高，但差异无统计学意见（P>0.05）；熊果酸、DPI干预后Gli2mRNA表达均明显低于瘦素组（均P<0.05）。上述结果表明熊果酸、DPI能下调瘦素介导的HSC-T6细胞Gli2mRNA的表达。 5.熊果酸干预对瘦素诱导的NOX亚基Rac1蛋白的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞24小时后，Rac1蛋白的表达较正常对照组升高（P<0.01）；熊果酸干预后Rac1蛋白的表达明显低于瘦素组（P<0.01），也低于正常对照组的表达（P<0.01）；DPI干预组细胞Rac1蛋白的表达低于瘦素组（P<0.01）。上述结果表明熊果酸、DPI均能抑制瘦素诱导的NOX亚基蛋白Rac1的表达。 6．熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Gli2蛋白的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞24小时后，细胞内Gli2蛋白的表达较正常对照组升高（P<0.01）；熊果酸干预后Gli2蛋白的表达明显低于瘦素组（P<0.01）；DPI干预组Gli2蛋白的表达低于瘦素组（P<0.01）。上述结果表明熊果酸、DPI均可以降低瘦素介导的Gli2蛋白的表达。 7.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖的影响 瘦素刺激HSC-T6细胞12h后细胞生长抑制率明显下降，与正常对照组相比具有统计学意义（P<0.01）；熊果酸作用HSC-T6细胞12h后细胞生长抑制率高于正常对照组（P<0.01）；熊果酸干预组、DPI干预组12h后细胞生长抑制率均显著高于瘦素组（均P<0.01）。随着作用时间延长，瘦素组生长抑制率进一步降低，而熊果酸组、DPI组生长抑制率逐渐增加，熊果酸干预组各时间点之间没有统计学差异（P>0.05）。上述结果表明瘦素可以促进HSC-T6细胞增殖，随着处理时间延长促细胞生长增殖作用增强，熊果酸干预可以持续抑制瘦素诱导HSC-T6细胞增殖。 结论： 熊果酸能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞Hh信号通路Shh、smo、Gli2mRNA表达，下调Gli2蛋白表达，并抑制肝星状细胞生长增殖，其作用可能通过抑制NOX亚基Rac1蛋白表达有关。