Wnt/β-catenin信号通路在TGF-β1诱导的真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化中作用和机制的研究

【研究背景】 增生性瘢痕是皮肤组织损伤后，创面愈合中过度纤维化的产物。肌成纤维细胞由成纤维细胞经表型转化而来，是导致增生性瘢痕形成的主要效应细胞。研究表明，TGF-β1是诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的关键刺激因素。TGF-β1除由经典的Smad分子介导其下游信号传导外，还与Wnt信号通路存在交互调控机制，共同参与多种生理病理过程。Wnt信号是调控器官和组织发育、干细胞分化的重要信号通路，已有报道提示它可能参与了创面愈合、纤维化疾病的发生、纤维化效应细胞的激活，但是具体作用可能存在组织器官特异性，潜在分子机制不明。特别是Wnt信号在真皮成纤维细胞表型转化中的作用，及其与TGF-β1信号的交互调控作用如何，尚不明确。 【研究目的】 1.明确增生性瘢痕组织及瘢痕成纤维细胞中，Wnt通路关键信号分子的表达调控机制。 2.明确外源调控Wnt信号对TGF-β1诱导的真皮成纤维细胞表型转化的具体作用，并初步探讨其作用机制。 【研究内容】 1.采用实时荧光定量PCR方法，对增生性瘢痕组织和瘢痕成纤维细胞中Wnt通路相关分子的表达进行检测。 2.用TGF-β1诱导正常真皮成纤维细胞表型转化，采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法，分别检测成纤维细胞转化过程中Wnt通路关键信号分子的表达变化。 3.使用SB216763活化Wnt通路，采用实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法，检测成纤维细胞表型转化标志分子表达特性的变化；用成纤维细胞三维凝胶收缩实验检测成纤维细胞收缩功能的改变。 4.构建β-catenin过表达载体，合成siRNA片段。 5.转染β-catenin过表达载体或siRNA片段，用实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法，检测成纤维细胞表型转化标志分子表达特性的改变。 6.用Wnt通路激活剂和转染β-catenin过表达载体的方法干预增生性瘢痕成纤维细胞，实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3、Smad7的表达变化。 7.用重组Wnt细胞因子干预成纤维细胞，观察其对成纤维细胞表型转化的作用。 【研究结果】 1.与自体正常皮肤相比，增生性瘢痕组织中Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt10b的表达水平显著下调。同样，与正常真皮成纤维细胞相比，增生性瘢痕成纤维细胞中Wnt2、Wnt4、Wnt10b的表达水平也显著下调。 2.正常成纤维细胞经TGF-β1诱导转分化过程中，Wnt2、Wnt4、Wnt10b的mRNA水平均显著上调。TGF-β1对β-catenin的mRNA水平没有明显的影响，但可以显著上调其蛋白表达水平。 3.用Wnt/β-catenin激活剂SB216763与TGF-β1共同作用于正常成纤维细胞后，TGF-β1诱导的α-SMA，Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达被显著抑制；细胞免疫荧光结果显示，α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量显著减少。三维凝胶收缩实验显示，SB216763作用后，成纤维细胞的收缩功能被显著抑制。 4.成功构建了β-catenin真核表达载体，合成siRNA片段。 5. β-catenin过表达载体转染成纤维细胞后，显著抑制了TGF-β1诱导的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达；细胞免疫荧光显示，β-catenin转染后，α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量显著减少；而β-catenin表达被抑制后，TGF-β1诱导的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达水平进一步上调。 6. SB216763和β-catenin过表达干预增生性瘢痕成纤维细胞后，α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达被显著抑制；TGF-β1和Smad3的mRNA水平被SB216763下调，而Smad7表达水平未出现显著变化。 7. Wnt4作用于成纤维细胞，抑制了TGF-β1诱导的α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达；抑制TGF-β1的自分泌机制；还能使肌成纤维细胞 发生逆分化。 【研究结论】 1.真皮成纤维细胞表型转化中，TGF-β1可能通过上调Wnt2、Wnt4、Wnt10b这些Wnt配体分子，激活Wnt/β-catenin信号通路，直接在蛋白水平活化β-catenin。 2.外源活化Wnt/β-catenin可以抑制TGF-β1诱导的真皮成纤维细胞表型转化，对TGF-β1诱导的成纤维细胞表型转化起负反馈调控作用。 3.外源激活Wnt/β-catenin信号，可抑制增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达。 4. Wnt/β-catenin通路抑制TGF-β1信号的促转分化作用，可能与其抑制了Smad3的表达和TGF-β1的自分泌机制相关。