矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对APPswe/PS1△E9转基因阿尔茨海默病模型小鼠神经保护的作用机制及对其肠道菌群的影响

背景阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以记忆丧失和认知衰退为主要临床症状的大脑神经退行性疾病。特征性的病理学表现有：p淀粉样肽(β amyloid peptides, Aβ)沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。目前有关AD的病因仍然不明确,临床上无有效的防治措施并且已有的临床治疗药物还存在毒副作用。越来越多的证据表明,天然植物化学物——矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)可以用于缓解包括AD在内的神经退行性疾病,但其发挥神经保护作用的机制尚未具体阐明,特别是由Cy3G触发的下游分子靶标尚未确定。在非酒精性脂肪肝、2-型糖尿病的研究中发现,Cy3G可以通过活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARy)通路调节脂代谢、改善胰岛素抵抗、缓解氧化应激。因此,本课题拟通过体外和体内实验探讨Cy3G是否通过上调PPARγ进而影响其下游相关的蛋白从而改善AD的认知功能；另外,还探讨了Cy3G对AD肠道微生物菌群的影响,以期能为Cy3G改善AD认知的机制研究及潜在临床应用提供新的思路。方法首先,采用p-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤作为AD细胞模型,通过体外实验初步探讨Cy3G是否通过上调PPAγ蛋白水平发挥神经保护作用。应用MTT法检测不同化合物对细胞活力的影响及Cy3G对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,并在此基础上,分别设立对照组(Control,未加任何处理因素),Aβ25-35损伤组(10μM的Aβ25-35损伤24h),Cy3G组(25μM的Cy3G孵育24h),(Cy3G+Aβ25-35)组(25gM的Cy3G孵育24h,再给与10μM的Aβ25-35继续损伤24h),(GW9662+Cy3G)组(20gM的GW9662预孵育3h,再与25μM的Cy3G共孵育24h)以及GW9662拮抗剂组(20μM的GW9662预孵育3h,再与25μM的Cy3G共孵育24h,最后加入10μM的Aβ25-35继续损伤24h)。使用透射电镜观察Cy3G对细胞膜和亚细胞器的超微结构以及对Aβ25-35寡聚体和纤维结构自发聚集过程的影响；使用刚果红染色(CR)和扫描电镜观察Cy3G对Aβ25-35与细胞膜结合的影响；利用Hoechst33258和DCFH-DA荧光探针分别检测细胞凋亡水平和细胞内活性氧(ROS)生成情况,并通过流式细胞仪进行定量分析；使用免疫印迹法检测PPARγ蛋白的表达水平。其次,从整体水平探讨Cy3G对APPswe/PS1△E9 (PAP)转基因AD模型小鼠行为学、脑葡萄糖代谢、病理进程等方面的影响,并进一步验证Cy3G是否通过活化PPARy从而发挥改善AD认知的生物学效用。将7月龄的PAP转基因AD小鼠模型随机分为AD模型组(PAP)、Cy3G治疗组(PAPCy,5mg/kg/d)、GW9662拮抗剂组(PAPiCy, 1mg/kg/d)及同窝阴性对照组(nPAP);另外选择相同月龄的正常野生型C57BL/6J小鼠分别作为空白对照组(WT)和Cy3G干预组(WTCy,5mg/kg/d);每组10～14只,雌雄各半,Cy3G灌胃8周。各组小鼠干预结束后,进行旷场实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验来观察Cy3G对AD模型小鼠自主活动和认知功能的影响；分别用血糖仪和小动物MicroPET/CT检测小鼠空腹血糖水平和脑葡萄糖代谢率；称量主要脏器质量并计算脏器系数；用生化方法检测小鼠肝肾功能及脂代谢相关指标；应用病理学检测方法观察组织形态结构的变化及脑中老年斑生成情况；用免疫分析法检测小鼠血清中胰岛素和瘦素水平变化；用免疫印迹法检测PPARγ下游靶蛋白Akt、JNK和GSK-3β表达水平。最后,在体内干预实验的基础上利用基于16S rRNA的高通量测序技术,从肠道微生态方面,通过检测小鼠结肠粪便中的微生物来探讨Cy3G对AD模型小鼠肠道菌群丰度、多样性及组成结构的影响；并应用病理学检测方法观察小肠形态结构、病理生理学变化；利用Luminex xMAP(?)多因子检测技术测定血清中与免疫炎症反应相关的指标。结果体外实验证实,Cy3G可以通过PPARγ途径缓解Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤。即在分子水平上,Cy3G可以抑制Aβ25-35与细胞膜表面结合、阻止Aβ25-35寡聚体和纤维状结构的自发聚集；在细胞水平上,由Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤,包括细胞凋亡水平升高、ROS生成增多,均可以被Cy3G所缓解；此外,Cy3G可以上调细胞核中介导糖／脂代谢的PPARγ蛋白的表达水平。而GW9662则抑制了Cy3G生物活性效用的发挥,下调PPARγ蛋白的水平。体内实验发现,Cy3G干预PAP小鼠8周后,能增加APPswe/PS1△E9转基因AD小鼠在新物体识别实验中的识别指数,减少Morris水迷宫隐藏平台实验中小鼠寻找平台所用的潜伏期,增加空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数和停留时间,但并不影响小鼠在旷场中的自主活动；Cy3G还可以降低PAP小鼠空腹血糖水平并改善脑(海马和额叶皮层)葡萄糖代谢异常,有效缓解PAP小鼠的脑萎缩程度,抑制脑中老年斑的形成,并能维持正常的脂代谢且无明显的肝肾毒性损伤,降低脑组织中P-JNK蛋白的表达、增加P-Akt和P-GSK-3β蛋白的表达；而GW9662可以阻断Cy3G改善小鼠认知功能损伤、糖脂代谢异常的生物学活性,但对Akt、JNK和GSK-3β蛋白表达无影响。肠道微生态研究发现,AD小鼠肠道菌群群落丰度、多样性及结构都发生了显著改变,这些菌群及其比例的改变可能与AD相关的病理和认知功能改变有关；Cy3G干预会使小鼠粪便菌群多样性和丰度均降低,特别是降低有害菌群——蓝藻细菌的丰度、下调厚壁菌门/拟杆菌门的相对丰度比例,促进变形菌门富集；并且GW9662拮抗剂可以阻碍Cy3G发挥降低蓝藻菌群的作用,同时显著下调AD小鼠中乳酸杆菌的相对丰度。此外,Cy3G可有效改善AD小鼠小肠粘膜上皮吸收细胞超微结构的异常,而GW9662拮抗剂并不影响Cy3G对小肠粘膜保护作用的发挥。但是,在免疫调节方面,Cy3G可降低正常野生型小鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)两种细胞因子水平,但对AD小鼠影响不大。结论Cy3G可能是通过活化PPARγ缓解Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤；Cy3G还可部分改善AD小鼠认知障碍及脑糖代谢异常,并部分逆转由AD造成的小鼠肠道菌群比例失调所致的肠道微生态紊乱,保护肠粘膜细胞结构。因此,Cy3G具有调节胰岛素抵抗和炎症反应的作用,可用于预防和缓解AD；同时也为临床通过Cy3G调节肠道菌群防治AD提供理论依据。