乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研究

人体作为一个超个体,其生理健康不仅会受到外界环境与自身基因的影响,也会受到机体自身寄居微生物的影响。人体内的微生物组可以看做是一个虚拟的器官,执行着机体的多种代谢功能。而人体大部分的细菌是寄居在肠道的,肠道微生物基因组被誉为人类的“第二基因组”。 正常成年人结肠内pH在5.5-7.0之间,并且肠道菌群结构趋于近似,拟杆菌属占肠道菌群30%,而肠杆菌属和肠球菌属的含量少于1%。肠道中的专性厌氧菌本身对于维持肠道菌群结构的平衡起着至关重要的作用,专性厌氧菌作为肠道中的菌膜屏障,主要通过两种途径来阻止肠道潜在致病菌(通常为兼性厌氧或需氧菌)及毒素在肠上皮细胞的粘附,其一,通过与肠上皮细胞紧密结合,占据空间；其二,通过竞争营养物质,产生酸性代谢产物,降低肠道pH。 据世界卫生组织的数据显示,全球每年约有60万人死于慢性HBV感染。截止至2010年,中国有1.2亿人感染HBV。HBV侵袭肝脏后在肝细胞内复制,从根本上损害肝脏功能,其诱导的机体适应性免疫应答会产生两种效果：杀死肝细胞和清除HBV病毒,经过数年的迁延,发展为肝硬化。在我国,肝硬化患者中血清HBV DNA阳性率高达76.7%。 肝硬化主要从以下三个方面影响肠道微环境：(1)门脉高压,导致静脉回流受阻,胃肠道淤血,组织水肿,胃肠蠕动减慢,进一步引起肠道通透性增加,pH值改变；(2)肝功能受损,导致胆汁酸分泌减少、对内毒素的清除能力下降等,影响肠道菌群的结构和代谢；(3)宿主抵抗力降低。以上三个因素共同作用,导致肠道微环境改变,肠道菌群失调。而在此影响下,乙肝肝硬化患者肠道中具体发生了怎样的改变,目前还没有一个完整准确的认识。 宏基因组学的研究方法具有明显的优势,是解决这一问题的一个很好的方法。宏基因组学是指直接提取环境样品中的宏基因组进行高通量测序和生物信息学分析。传统微生物学以及微生物基因组学都是以可培养的微生物克隆产物为基础的,而目前自然界中有大于99%的细菌在实验室无法检出,培养的局限性使人们错过了捕捉众多微生物多样性的机会。由于宏基因组学可以揭示先前隐藏在微环境中的物种多样性,是理解整个生命世界的一次改革,使人们在观察微生物世界时拥有更为宽广的视野。宏基因组学研究的测序数据庞大而且复杂,包含代表着10,000个物种的DNA片段。从如此庞大复杂的数据中收集、提取有用的生物学信息无疑向研究者提出了很大的挑战。 因此,本课题首次利用宏基因组学的方法分析了乙肝肝硬化患者的肠道菌群结构变化及功能代谢变化。选取16例乙肝肝硬化患者作为病例组,20例健康人作为对照组,分别来自于中国人民解放军302医院消化科的病人和病人的家属。研究对象均为40～60岁,身体质量指数在18.5～24.9kg m-2之间,无明显的饮食偏好。病例组要求患者血清HBV DNA阳性,肝组织学上存在弥漫性纤维化及假小叶形成,临床诊断为乙肝后肝硬化,无并发症,无结肠炎等胃肠道疾病,无其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和正常人在留取肠道粪便样品的前一周未服用抗生素、类固醇等激素、中草药制剂(包括口服,肌肉注射或静脉注射),未服用微生态制剂或酸奶等益生菌。提取病例组和对照组的肠道微生物宏基因组DNA,进行高通量Solexa测序,并对测序结果进行生物信息学分析,包括稀释分析,主成分分析,显著差异基因的物种注释,eggNOG功能注释,KEGG代谢通路的注释及分析等。 研究结果发现,与正常人相比,乙肝肝硬化患者肠道菌群结构发生改变,主要表现为拟杆菌属显著减少(P<0.05),韦荣氏球菌属和肠杆菌科显著增加(P<0.05),另外,乙肝肝硬化患者肠道微生物的功能代谢发生改变,与氨基酸的转运和代谢、无机离子的转运和代谢、次级代谢产物的转运和代谢、能量及异生物质的代谢等功能相关的基因相对丰度显著增加(P<0.01),而与细胞壁/膜的生物起源、信号转导机制、复制、重组和修复等功能相关的基因相对丰度显著减少(P<0.05),胆汁酸代谢分析发现,肝硬化患者肠道微生物中次级胆汁酸代谢通路相关的基因相对丰度显著减少(P=0.013)。 初级胆汁酸在肝脏中合成,随胆汁进入肠道,在胆酸盐水解酶的解离和脱羟基作用下分解为次级胆汁酸。拟杆菌属产生胆酸盐水解酶,而胆酸盐水解酶介导的解离和脱羟基作用为拟杆菌属提供碳源、氮源和能量来源,二者相互依存,一方减少,另一方也随之削弱。 肠道中的胆盐达到一定浓度后会聚合成极性微胶粒,肠道中的脂肪酸、甘油一酯等代谢产物与微胶粒结合被运载到肠粘膜表面而被吸收。韦荣氏球菌属会水解聚合的胆盐,阻碍微胶粒形成。乙肝肝硬化患者肠道中韦荣氏球菌属显著增加,因此微胶粒合成受阻,胆汁滞留,胆道部分阻塞,从而加重肝硬化。 有研究表明,韦荣氏球菌属和肠杆菌科通常在人体空肠分离物中检测到,而它们在肝硬化患者结肠中的显著增加,可能是细菌易位的结果。韦荣氏球菌属和肠杆菌科均为革兰氏阴性细菌,可以产生内毒素。在正常人当中,由于肝脏Kupffer细胞的清除功能,内毒素在血液中的含量极其微弱,小于0.1EU/ml,不会形成内毒素血症影响到正常人的身体健康。而肝硬化患者肝脏清除功能降低,门-体侧枝循环形成,门脉高压导致肠壁水肿和通透性增加,在这些因素的共同作用下,内毒素入血增加。一方面,内毒素会诱导一些细胞因子(如TNF,IL-1和IL-6)的分泌,这些细胞因子会引起细胞外基质的合成和降解异常,从而促进肝纤维化的进程。另一方面,肠道中韦荣氏球菌属和肠杆菌科过度繁殖,产生的过量内毒素会抑制肠上皮细胞的蛋白质合成,因此肠壁屏障受损,进一步威胁到肠道微环境,导致肠道菌群失调。另外,内毒素抑制肠上皮细胞蛋白质的合成,从而改变肠壁上的载体锚定点,导致氨基酸和碳水化合物等物质在运输过程中出现异常或缺陷。 乙肝肝硬化患者肠道微生物富集物质转运和代谢功能相关的基因,而缺失细菌周期相关的基因。由此推测,由于门脉高压,肝功能障碍,宿主抵抗力降低等因素共同作用,肠道微环境发生改变,对肠道菌群的生长造成了一个逆环境,在这种压力条件下,促进了一些肠道菌群对物质转运和代谢的作用加强,形成更为广泛的代谢途径。 本课题首次从一个综合的角度和宽广的视野向人们展现了肝硬化患者肠道微环境的变化,并发现肝硬化与肠道菌群失调之间存在多个恶性循环,肝硬化患者的微生态治疗对于疾病的预后至关重要。