乳糖化—去甲斑蝥素磷脂复合物pH敏感型脂质体的研究

目的:合成乳糖化-去甲斑蝥素(lactosyl-norcantharitin,Lac-NCTD)磷脂复合物,从而提高Lac-NCTD的脂溶性,将其通过逆向蒸发法制备脂质体,并利用羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCT)与脂质体表面的静电吸附作用,制备Lac-NCTD磷脂复合物pH敏感型脂质体,以期其在弱酸性的肿瘤部位主动释药,增强Lac-NCTD的抗肿瘤活性。 方法:(1)通过溶剂蒸发法合成Lac-NCTD磷脂复合物,以复合率为指标,考察反应溶剂、Lac-NCTD投药浓度、Lac-NCTD与磷脂投料比、反应温度、反应时间对复合率的影响,通过单因素和正交试验设计优化制备工艺,红外光谱分析(FT-IR)、差示扫描量热分析(DSC)和核磁共振分析(1H-NMR)表征磷脂复合物结构,测定磷脂复合物的表观油水分配系数,通过高效液相色谱(HPLC)考察磷脂复合物的性质。(2)分别以Lac-NCTD和Lac-NCTD磷脂复合物为原料药,分别采用逆向薄膜蒸发法蒸发法和逆向蒸发法制备脂质体,通过均匀设计优化脂质体制备工艺,考察脂质体包封率、载药量、粒径分布及Zeta电位。(3)通过CMCT与Lac-NCTD磷脂复合物脂质体表面的静电吸附作用,使CMCT包裹在脂质体表面,制得pH敏感型脂质体,并考察其与未包裹CMCT的脂质体在不同介质中的体外释放性质,与Lac-NCTD脂质体的释放特性进行比较。(4)通过MTT法考察Lac-NCTD、两种空白脂质体与两种载药脂质体对人体肝癌细胞HepG2的细胞毒作用。(5)采用HPLC法评价HepG2细胞对Lac-NCTD及其脂质体的摄取过程。(6)建立H22肝癌细胞小鼠荷瘤模型考察脂质体在体内抗肿瘤活性。(7)通过荧光染料Cy-7分子结构中的羧基与羧甲基壳聚糖中的伯胺发生反应,用Cy-7标记CMCT,制备Cy-7荧光标记的pH敏感型乳糖化-去甲斑蝥素磷脂复合物脂质体,通过小动物活体成像仪,采集荧光信号,考察该脂质体在小鼠体内的靶向性。 结果:(1) Lac-NCTD磷脂复合物的复合率为97.2±2.01%,其表观油水分配系数为Lac-NCTD的135倍,脂溶性显著改善。FT-IR、DSC及1H-NMR表征磷脂复合物结构得,磷脂复合物是由氢键缔合产生的复合物,其不同于药物与磷脂的普通物理混合物;HPLC检测结果显示Lac-NCTD磷脂复合物具有与Lac-NCTD相同的保留时间,表明磷脂复合物也不是一种全新化合物。(2)磷脂复合物脂质体的平均包封率为70.00±1.30%,载药量为2.24±0.43%,平均粒径为47.18±4.16nm,粒径跨距为0.70±0.07,Zeta电位为-26.0±2.97mV,电镜显示其形态圆整;Lac-NCTD脂质体包封率为38.12±1.12%,载药量为1.22±0.21%,平均粒径为83.14±9.64nm,粒径跨距为0.63±0.07,Zeta电位为-11.0±2.42mV。(3) Lac-NCTD脂质体体外释药符合Higuchi方程;pH敏感型脂质体体外释药符合Weibull方程,并且在pH5.9～7.4的介质中表现出显著的pH依赖性和爆破释放效应。(4)与Lac-NCTD、Lac-NCTD脂质体相比,pH敏感型脂质体在体外对肿瘤细胞HepG2的亲和性更好,细胞毒作用更显著。(5)体内抑瘤实验表明,pH敏感型脂质体可以更好地抑制H22肿瘤的生长,保护免疫器官。(6) pH敏感型脂质体可以靶向聚积在小鼠肝脏和肿瘤部位,有很好的靶向作用,从而减小药物毒副作用,提高抗肿瘤效果。 结论:优化的药物磷脂复合物制备工艺简单易行,成本低,复合率高,可以显著提高药物脂溶性,从而提高其在脂质体中的包封率,羧甲基壳聚糖包裹的脂质体体外释药有显著的pH敏感性,可以在呈弱酸性的肿瘤部位主动释药,并对肝脏肿瘤部位具有靶向性,从而表现出更好的抗肿瘤作用。