鸟枪法脂质组学分析磷脂和胆固醇酯及其应用

本文主要分为三个部分。第一部分利用基于鸟枪法的脂质组学研究策略,分别建立了直接进样电喷雾串联质谱法分析磷脂和流动注射电喷雾串联质谱法分析胆固醇酯的方法,并应用这两种方法分析了一些生物样本中磷脂和胆固醇酯的分子种和含量；第二部分利用直接进样电喷雾串联质谱法分析了草鱼在不同温度储藏过程中,肌肉组织的磷脂分子种和含量的变化过程；第三部分利用鸟枪法脂质组学研究策略,观察口灌恩诺沙星后鲫鱼肝脏膜脂的变化,考察恩诺沙星对鲫鱼肝脏膜脂代谢所产生的影响。 首先,本文建立了直接进样电喷雾串联质谱测定磷脂和流动注射电喷雾串联质谱测定胆固醇酯的方法。采用流动注射泵直接进样或液相泵流动注射的方式将样品导入电喷雾离子源,利用三重四级杆质谱的母离子扫描或中性丢失扫描功能,通过扫描磷脂和胆固醇酯的特征性子离子或中性质量丢失实现对六类磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸)和胆固醇酯的定性和定量。方法学评价显示,在一定的浓度范围内,磷脂和胆固醇酯的浓度与其经电喷雾电离后形成准分子离子的响应值呈现良好的线性关系,且回收率和精密度较好。鸟枪法脂质组学研究策略具有前处理简单,特异性强,分析速度快,定性定量快速准确且方法稳定等特点,适合生物样品中磷脂和胆固醇酯的分析。 其次,应用鸟枪法脂质组学研究策略分析了一些生物样本中磷脂和胆固醇酯的分子种和含量。一方面,应用直接进样电喷雾串联质谱法测定了2种淡水鱼(草鱼和鲫鱼)和3种海水鱼(带鱼、鲳鱼和老虎鱼)肌肉组织中磷脂的分子种及含量。结果表明,淡水鱼中溶血性磷脂和多烯磷脂的含量小于海水鱼,且海水鱼中具ARA、EPA和DHA的多烯磷脂含量较高。这些多烯磷脂比大豆多烯磷脂具有更高的生物活性和营养价值,有很大的应用潜力。另一方面,应用流动注射电喷雾串联质谱法测定鸡蛋黄和青蟹黄中胆固醇酯的分子种及含量。结果表明,鸡蛋黄中胆固醇酯分子种主要是偶数碳原子个数的脂肪酸胆固醇酯,而青蟹黄中还存在一些奇数碳原子个数的胆固醇酯分子种；鸡蛋黄中饱和脂肪酸胆固醇酯和多不饱和脂肪酸胆固醇酯的含量均低于青蟹黄,而单不饱和脂肪酸胆固醇酯含量高于青蟹黄；鸡蛋黄中多不饱和脂肪酸胆固醇酯主要为CE 18：2,而青蟹黄中主要为CE 22：6、CE 20：5和CE 20：4。 其后,应用直接进样电喷雾串联质谱法研究了草鱼在+20℃,+4℃和-20℃温度下分别储藏72 h,3 d和90 d过程中肌肉组织的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸分子种和含量的变化。结果显示,在+20℃储藏72 h和+4℃储藏7d过程中,磷脂组分基本呈先逐渐上升,再缓慢减少的趋势。溶血性磷脂的变化趋势与磷脂的变化趋势基本上一致,但略有不同。在+20℃储藏条件下,磷脂的劣变要远远快于+4℃储藏条件下。在+20℃和+4℃储藏过程(?)一些低丰度的PE分子种,如PE16:0/16:1、PE 16:1/18:1和PE16：0/18：1等的含量逐渐上升。这些特殊的PE由鱼肉腐败过程中微生物产生,其含量有望成为评价鱼肉品质的一个新指标。在-20℃储藏90d的过程中,草鱼肌肉组织中磷脂和溶血性磷脂含量变化不明显,表明磷脂和溶血性磷脂在低温储藏过程中能够保持长时间的稳定。 最后,采用基于鸟枪法的脂质组学研究策略,研究口灌恩诺沙星后鲫鱼肝脏膜脂(磷脂和胆固醇酯)的变化过程,考察恩诺沙星对鲫鱼肝脏膜脂代谢的影响。结果显示,低浓度的恩诺沙星对鲫鱼肝脏细胞膜脂的组成和含量均会产生较大的影响,主要表现在磷脂含量的降低,溶血性磷脂和胆固醇酯含量的上升。随着恩诺沙星逐渐代谢转化,膜脂逐渐恢复正常。本研究结果表明,低剂量短期灌喂恩诺沙星对鲫鱼肝脏膜脂代谢影响及生物膜系统的损害作用有限。若使用中注意控制药量,则可以将其对鱼体的危害降到最低；若加大剂量或增加给药次数,则恩诺沙星对肝脏的影响程度将不再是轻微的生化指标改变,严重的可能发生肝功能衰竭并导致鱼体死亡。