幽门螺杆菌感染对胃黏膜上皮细胞DNA损伤修复机制的影响

背景与目的:胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一。最新全球癌症的流行病学数据表明:全球胃癌男、女性新发病人数分别占癌症的第4位和第5位,男、女胃癌病死率分别占癌症相关死亡的第3位和第5位。我国是胃癌发病大国,全球每年新发胃癌半数以上在中国。大多数胃癌病例确诊时已处晚期,治疗方法有限、预后不佳。明确胃癌的发生机制,制定有效的胃癌一级预防策略迫在眉睫。DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是一种最严重的DNA损伤形式,其精确修复依赖于DNA损伤信号通路的激活传递及各种修复蛋白的协同发挥功能。细胞自噬对基因组稳定亦发挥重要作用,细胞自噬的缺陷可通过影响DNA损伤修复过程中关键蛋白的活性导致DNA修复异常。DNA损伤修复机制的缺陷易引起基因组的不稳定,而这种基因组的不稳定性毫无疑问对肿瘤的发生发展起着十分重要的促进作用。目前认为,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性非萎缩性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一演变过程的始动因素,然而其确切致癌机制尚不清楚。Hp感染是否可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs?DNA损伤反应信号通路及细胞自噬如何变化?Hp感染是否可以通过干扰DNA的修复机制进而导致基因组不稳定性,引起细胞生物学功能的异常......?本研究将针对以上问题进行探讨,为阐明Hp的致癌机制提供新的理论依据。材料与方法:(一)Hp感染诱导胃黏膜上皮细胞DSBs的体内外研究:1.收集慢性非萎缩性胃炎(chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)、异型增生(dysplasia,Dys)和胃癌(gastric cancer,GC)组织,通过免疫组化检测各病变阶段γH2AX(DSBs的检测指标)的表达,并分析其与Hp感染的关系;2.通过建立Hp活菌体外与GES-1细胞共培养细胞模型,Western blot检测γH2AX的表达,中性单细胞凝胶电泳实验检测DSBs;3.构建Hp感染蒙古沙鼠动物模型,免疫组化检测胃黏膜组织γH2AX的表达。(二)Hp感染对DNA损伤修复信号通路及细胞自噬的影响:1.免疫组化检测不同病变阶段胃黏膜标本DNA损伤修复通路、细胞自噬相关蛋白的表达,并分析其与Hp感染的关系;2.检测Hp活菌体外与GES-1细胞共培养后DNA损伤修复通路、细胞自噬相关指标的变化;3.利用Ad-m RFP-GFP-LC3腺病毒检测Hp活菌作用GES-1细胞后自噬流的变化;4.流式细胞术检测Hp活菌与GES-1细胞培养后细胞周期变化;5.Hp活菌与Rad51过表达或敲除的GES-1细胞共培养,检测DSBs及相关指标的变化。(三)细胞自噬对Hp诱导GES-1细胞DSBs损伤修复的影响:1.Hp活菌与自噬干预后GES-1细胞共培养,检测DSBs及相关指标、Rad51的表达和细胞周期的变化;2.同时干预GES-1自噬水平及Rad51表达水平,观察自噬对DNA损伤修复的调节是否依赖于Rad51的表达。结果:(一)Hp感染诱导胃黏膜上皮细胞DSBs的体内外研究:我们通过检测不同病变阶段胃黏膜标本中γH2AX的表达,发现其在胃黏膜癌变过程中发挥重要作用,且γH2AX表达与胃癌部位、大体分型、分化程度、肿瘤浸润深度、TNM分期和淋巴转移相关,与胃癌预后呈负相关;进一步分析发现γH2AX在Hp阳性IM与Dys组织的表达高于Hp阴性组。通过构建Hp活菌体外与GES-1细胞共培养,发现Hp感染可诱导GES-1细胞发生DSBs。进一步在蒙古沙鼠模型进行验证,发现Hp感染可诱导蒙古沙鼠胃黏膜上皮细胞γH2AX的高表达。上述实验结果提示:Hp体内外感染均可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs。(二)Hp感染对DNA损伤修复信号通路及细胞自噬的影响:我们检测了不同胃黏膜病变阶段中DNA损伤修复通路、细胞自噬相关蛋白的表达,发现DNA损伤修复通路及细胞自噬参与胃黏膜的癌变过程,且与胃癌临床病理参数密切相关,其中Beclin-1、p62和BRCA2表达与胃癌预后呈正相关,而p-ATM(S1981)、Rad51表达与胃癌预后呈负相关。进一步分析各病变阶段Hp阳性亚组与Hp阴性亚组间的差异,发现:(1)在CNAG和IM病变阶段,Hp阳性亚组中p-ATM(S1981)、p-Chk2(T68)、p-p53(S15)的表达均高于Hp阴性亚组;(2)在Dys病变阶段,Hp阳性亚组中Rad51的表达低于Hp阴性亚组。在细胞实验中,我们发现Hp活菌作用GES-1细胞6h后即可激活DNA损伤反应信号通路以及细胞自噬,诱导细胞发生S期阻滞;但随着作用时间延长,12h后Rad51蛋白表达和自噬水平均呈下降趋势;转染Rad51质粒对Hp诱导的GES-1细胞DSBs起保护作用,敲除Rad51则作用相反。动物实验进一步证实,Hp感染12月亚组蒙古沙鼠胃黏膜组织p62表达水平高于对照组;Hp感染18月亚组蒙古沙鼠胃黏膜组织Rad51表达水平低于对照组。上述实验结果提示:DNA损伤修复信号通路在胃黏膜癌变早期发挥重要的抗癌屏障作用;Hp感染可激活胃黏膜上皮细胞DNA损伤信号通路及细胞自噬,但随着感染时间延长,Hp感染可下调自噬水平并导致DNA同源重组修复能力下降。(三)细胞自噬对Hp诱导GES-1细胞DSBs损伤修复的影响:我们采用两种自噬激动(Rapamycin和饥饿处理)及自噬抑制剂(3-MA和Baf A1)对GES-1细胞进行预处理,后与Hp活菌共培养;发现上调自噬可促进GES-1细胞Rad51表达,减少DSBs发生,而抑制自噬则下调GES-1细胞Rad51表达,并促进DSBs发生;进一步行补救实验(即在上调自噬的同时敲除Rad51或抑制自噬的同时过表达Rad51),发现细胞自噬对DSBs的保护作用依赖于Rad51的表达。结论:1.Hp感染可诱导胃黏膜上皮细胞发生DNA双链断裂并激活DNA损伤应答信号通路;DNA损伤应答信号通路的激活在早期胃黏膜癌变过程中发挥重要抗癌屏障作用。2.Hp感染可通过抑制细胞自噬水平,降低Rad51表达,进而影响胃黏膜上皮细胞DNA损伤修复机制。