赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的超微量免疫分析

目的 采用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术,建立赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素B1（AFB1）的高灵敏的TRFIA的检测方法,并研制具有我国自主知识产权的快速、灵敏的OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒,提高我国在毒素超微量免疫检测的水平,解决我国农产品安全检测方面的一些迫切要求,应对国际上技术壁垒的挑战。 方法 1. OTA的TRFIA研究:首先采用碳二亚胺法,制备人工抗原OTA-KLH。以OTA-KLH免疫大白兔制备多克隆抗体。以OTA-BSA免疫BALB/c鼠,制备抗OTA单克隆抗体。选择包被浓度、标记条件、反应步骤、反应方式,配制增强液、洗液,编制全自动操作软件;以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪,建立多克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪,建立单克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。组建OTA-TRFIA检测试剂盒。按照标记免疫试剂要求,分别对OTA-TRFIA试剂盒进行灵敏度、精密度、准确度、回收率、特异性、稳定性考核,应用OTA-TRFIA试剂盒检测国际质控,并与进口的OTA-ELISA试剂盒进行对照。 2. AFB1的TRFIA研究:将AFB1-BSA免疫新西兰大白兔得到抗AFB1多克隆抗体。用黄曲霉毒素B1与辣根过氧化酶的联结物（AFB1-HRP）包被96孔板为固相抗原,以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法建立AFB1-TRFIA。组建AFB1-TRFIA检测试剂盒,对其进行考核,并与ELISA试剂盒进行对照。 结果 1.制备了可以用于免疫和筛选的OTA-KLH人工抗原,得到了抗OTA多克隆抗体和单克隆抗体。采用DTTA法,制备了Eu3+-羊抗兔抗体和Eu3+-羊抗鼠抗体。配制了所有的相关试剂,编制了全自动的分析软件,组建了OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒。 2.应用多克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.02μg /L,测量范围为0.02μg /L -400μg /L,批内和批间变异分别为2.6%和5.2%,平均回收率为95.8%。OTA-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为0.195g/L, 1.018g/L和5.314g/L。3.应用单克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.03μg /L,测量范围为0.03μg /L -1000μg /L,批内和批间变异分别为3.7%和5.3%,平均回收率为94.2%。间接竞争