大豆制品是人类重要的植物蛋白资源。乳酸菌发酵可显著改善大豆制品的营养价值,但目前国内外研究多集中在乳酸菌发酵对大豆制品营养成分和风味的改变上,很少研究报道乳酸菌发酵对大豆制品其它生物活性,如抗氧化和ACE抑制活性的影响。本论文首先选育了适合固态发酵豆粉的乳酸菌菌株,在此基础上,对乳酸菌固态发酵豆粉的条件,发酵过程中营养成分的变化,发酵对豆粉抗氧化和ACE抑制活性的影响,发酵产物中ACE抑制和抗氧化活性肽的制备与分离纯化,发酵豆粉中活性肽对生物大分子和离体培养小鼠胸腺细胞氧化损伤的抑制作用及其机制,以及乳酸菌发酵酶解豆粉缓解实验动物断奶应激进行了研究。
1.乳酸菌发酵酶解豆粉菌株选育及发酵条件优化研究
本文首先对适于固态发酵豆粉的乳酸菌菌株进行了选育,通过比较不同乳酸菌菌株在豆粉中生长和产酸性能、以及发酵产物中蛋白质水解度,选育出植物乳杆菌Lp6（L.plantarum Lp6）作为最终的发酵菌株,通过单因素和正交优化实验,得出Lp6固态发酵豆粉的最佳条件为接种量为0.2%,含水量为55%,酸性蛋白酶添加量为0.5%,自然pH值,37℃密闭发酵72 h。
2.乳酸菌发酵酶解豆粉过程中成分变化研究
以植物乳杆菌Lp6固态发酵酶解豆粉,对发酵过程中蛋白质等营养成分的变化进行了研究。乳酸菌发酵可显著提高豆粉中蛋白质的体外消化率,分子量分布分析表明,豆粉中蛋白质降解,生成小分子肽。同时,豆粉中游离氨基酸含量显著增加。发酵还可使豆粉中总糖含量减少,还原糖含量增加,水苏糖和棉籽糖等胀气因子含量显著下降。抗营养因子含量分析表明,乳酸菌发酵可显著降低豆粉中胰蛋白酶抑制因子、植酸和脲酶等抗营养因子含量。
3.乳酸菌发酵酶解豆粉中活性肽的制备
乳酸菌发酵酶解可显著增强豆粉的ACE抑制活性和DPPH、·OH自由基清除能力,但对其Fe2+螯合能力影响不显著。发酵豆粉蛋白提取物经大孔吸附树脂除盐、除糖,中空纤维膜超滤处理后,其蛋白质含量提高,糖和灰分含量降低,其中分子量小于1500 Da的肽含量在90%以上,且ACE抑制和抗氧化活性显著增加。活性肽经消化酶和ACE处理后,仍然保持较强的ACE抑制活性,说明其主要含有抑制型的ACE抑制肽,且具有通过胃肠道进入血液循环的可能性,从而在体内发挥降血压作用。
4.发酵酶解豆粉中活性肽的抗氧化作用研究
乳酸菌发酵酶解豆粉中活性肽可抑制质粒pBR322 DNA中开环和链状DNA的生成,抑制牛血清白蛋白中羰基的产生,从而减轻氧化剂对其造成的氧化损伤。用乳酸菌发酵豆粉中活性肽处理小鼠胸腺细胞,可提高H2O2损伤细胞的活性,提高其中T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT的活性,降低细胞中ROS和MDA的含量,提高细胞中GSH的含量和GSH/GSSG值,同时,发酵豆粉中活性肽下调细胞中p53 mRNA的表达水平,抑制p53基因介导的细胞调亡,减轻细胞的氧化损伤。
5.发酵酶解豆粉中活性肽的分离纯化和结构鉴定
本论文分离纯化得到了发酵豆粉中一种具有较强ACE抑制和抗氧化活性肽。样品经Sephadex G-15凝胶柱分离,对具OLC分离,借助MALDI-TOF-MS/MS和氨基酸组成分析确定活性峰7-Ⅱ-f-R2的氨基酸序列为VPDALR,其ACE抑制和·OH清除活性IC50值分别为29.3μg/mL、83.2μg/mL。
6.乳酸菌发酵酶解豆粉缓解断奶应激研究
在断奶仔猪日粮中添加乳酸菌发酵酶解豆粉,显著增加了断奶仔猪ADG,并且改善了FCR,降低仔猪血浆中TG含量,增加HDL含量,但对CHOL和LDL影响不显著。同时,还能够提高断奶仔猪抗氧化酶活性,增强机体的抗氧化能力。仔猪肠道菌群分析表明,日粮中添加乳酸菌发酵酶解豆粉,可增加其肠道中乳酸杆菌的数量,降低大肠杆菌的数量,但对双歧杆菌的数量影响不显著。添加发酵豆粉,能增加仔猪肠道消化酶活性,降低肠道内容物pH值,增加其中挥发性脂肪酸的含量。小肠粘膜形态结构分析表明,日粮中添加发酵豆粉,可显著增加仔猪小肠绒毛高度,绒毛高度与隐窝深度比值也显著增加。上述结果表明,乳酸菌发酵酶解豆粉可有效缓解断奶对动物造成的应激。
