温针灸对兔膝骨性关节炎软骨细胞JNK信号通路及MMP-1、13表达的影响

目的观察温针灸治疗前后MMP-1、13的表达,以及JNK信号通路中JNK1、2的表达情况,探讨温针灸治疗膝骨性关节炎的作用机理。方法新西兰大耳兔40只,随机分为温针灸组、针刺组、模型组和空白对照组,采用右后肢膝关节伸直位石膏固定法制备兔膝骨性关节炎模型。造模完成后,温针灸组在鹤顶、内外膝眼予以温针灸,灸一柱;针刺组在鹤顶、内外膝眼予以针刺,留针15分钟,两组均每日1次,6天为一个疗程,中间休息1天,共治疗2个疗程;模型组每天在兔架上固定15min;空白对照组不做任何干预,正常饲养。治疗结束后取材。参考彭太平大体观察法及HE染色观察膝关节组织形态学变化;采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测造模前、治疗前和治疗后兔血清中MMP-1、13表达变化;免疫组化检测关节软骨中MMP-1、13的表达变化;Western Blot法检测JNK1、2蛋白的表达变化。所有结果均采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。结果1、大体观察结果显示模型组关节面不光滑,无光泽,有骨赘形成,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);温针灸组关节面光滑,稍欠光泽,表面干净,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);针刺组关节面欠光滑、欠关泽,无骨赘形成,与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2、HE染色结果显示:空白对照组软骨表面光滑,结构完整,软骨细胞排列整齐,呈四层,染色均匀;模型组软骨变薄,软骨细胞数量减少,可见软骨细胞成簇排列,排列紊乱;温针灸组软骨细胞增多,且排列整齐,软骨边缘光滑;针刺组软骨稍欠光滑,软骨细胞偶可见成簇排列,细胞数目稍增多,排列较整齐。3、治疗前后血清中mmp-1、13的表达水平比较:除空白对照组外,各组治疗前较造模前血清mmp-1、13的浓度均显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);治疗结束后,模型组与空白对照组比较,血清mmp-1、13表达升高,差异有统计学意义(p<0.05);温针灸组血清mmp-1和mmp-13表达较模型组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),较针刺组有降低,但差异无统计学意义(p>0.05);针刺组与模型组比较,血清中mmp-1、13表达量有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。4、免疫组化检测光学显微镜下mmp-1、13表达的阳性结果分布:空白对照组中mmp-1、13只有散在的阳性表达,且表达不明显;模型组软骨细胞着色相对较深,以棕黄色、褐色颗粒为主,且细胞外基质中也有少量着色;温针灸组软骨细胞mmp-1、13的阳性表达主要以浅棕褐色的颗粒为主,表层稍有分布深褐色颗粒;针刺组的阳性表达较为明显,而且表层与中层颜色较深的棕黄色颗粒分布较高。5、免疫组化检测关节软骨中mmp-1、13的表达水平变化:与空白对照组比较,模型组mmp-1、13蛋白的表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);温针灸组与模型组比较,mmp-1、13的表达明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);针刺组与模型组比较,差异无统计学意义(p>0.05);针刺组与温针灸组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。6、westernblot检测关节软骨中jnk1、2的表达水平变化:经灰度值分析,模型组软骨中jnk1、2的表达量明显增高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05);温针灸组与模型组比较,jnk1、2的表达明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);针刺组与模型组比较,jnk1、2的表达下降,但差异无统计学意义(p>0.05);针刺组与温针灸组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。结论温针灸治疗koa可能是通过激活jnk信号通路,抑制mmp-1、13的表达而发挥其治疗作用。