扶正祛邪方及其有效组分愈创醇通过抑制M2型巨噬细胞阻抑肺癌上皮间质转化的分子机制研究

目的:扶正祛邪方是临床治疗肺癌的有效复方,其有效组分及作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨扶正祛邪方及其有效组分愈创醇在肺癌治疗中的潜在应用价值及可能的分子机制。方法:首先构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型,明确扶正祛邪方体内阻抑肺癌的作用,探究其对免疫微环境中肿瘤相关巨噬细胞的调节作用。然后对课题组前期工作筛选出的扶正祛邪方有效组分愈创醇进行深入研究。先构建巨噬细胞清除Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,明确愈创醇体内抗肺癌效应与其抑制巨噬细胞的M2表型有关,而非调控巨噬细胞M1表型。其次在体外成功构建M2巨噬细胞的诱导模型,利用CCK-8实验筛选愈创醇作用的最佳效应浓度,采用流式细胞技术检测愈创醇对M2巨噬细胞的抑制作用。然后通过体外建立巨噬细胞与肺癌细胞共培养体系,模拟肿瘤免疫微环境,采用增殖、划痕及侵袭实验观察愈创醇对共培养体系下肺癌生物学行为的阻抑作用。随后通过生物信息学分析筛选M2巨噬细胞促进肺癌的可能分子机制,根据富集分析结果并结合文献报道,通过ELISA实验筛选愈创醇作用的关键信号分子,利用实时荧光定量PCR技术及蛋白免疫印迹法检测肺癌上皮间质转化标志物、巨噬细胞作用的关键信号分子及其参与调节的下游信号通路分子的表达。最后利用关键信号分子拮抗剂阻断其信号传递,观察其参与调节的下游信号通路分子以及肺癌上皮间质转化标志物的变化,验证愈创醇通过抑制M2巨噬细胞功能阻抑肺癌上皮间质变化的分子机制。结果:构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型,分别进行低剂量、高剂量扶正祛邪方灌胃,结果显示,实验终点时,与模型对照组比较,低剂量、高剂量扶正祛邪方均可有效抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤体积(P<0.001)和瘤体重量(P<0.05,P<0.001),阻抑上皮间质转化分子标志物,促进E-cadherin的RNA表达(P<0.001),抑制 N-cadherin(P<0.05)、Vimentin(P<0.001)以及 snail(P<0.001)的 RNA表达,并能抑制M2型巨噬细胞相关mRNA Arg-1(P<0.01)、IL-10(P<0.01)、IL-13(P<0.001)的表达及CD206蛋白的表达(P<0.001)。其次,构建巨噬细胞清除Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,结果显示,巨噬细胞参与了肿瘤的生长过程,对Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长有促进作用(P<0.05),愈创醇可有效抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的体积(P<0.05)和瘤体重量(P<0.05),进一步分离Lewis肺癌小鼠瘤体及脾脏制备成单细胞悬液,采用流式细胞技术对巨噬细胞进行鉴定,结果显示,愈创醇对Lewis肺癌小鼠瘤体及脾脏的M2型巨噬细胞表面膜分子CD206的表达均有显著的抑制作用(P<0.001),对M1型巨噬细胞未显示有显著的调节作用(P>0.05);因此在体外建立M2型巨噬细胞诱导活化模型,CCK-8实验结果显示,愈创醇对M2型巨噬细胞及LLC细胞作用的IC50分别为232.1μM,174.6μM,愈创醇处理后的M2型巨噬细胞形态与未经诱导活化的巨噬细胞形态相似,流式细胞技术结果显示,40μM、60μM浓度愈创醇对M2型巨噬细胞具有显著抑制作用(P<0.001);建立巨噬细胞与肺癌细胞共培养体系,CCK-8实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞增殖能力,划痕实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞的迁移能力,Transwell实验显示愈创醇可抑制共培养体系下肺癌细胞的侵袭能力;RT-PCR结果显示,愈创醇可阻抑共培养体系下肺癌上皮间质转化过程,增加E-cadherin的RNA表达水平(P<0.001),同时降低N-cadherin和Vimentin的RNA表达水平(P<0.001),Western Blot实验的结果显示,愈创醇可增加E-cadherin的蛋白表达水平,同时降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。最后,通过GEO数据库及TCGA数据库分析显示,M2型巨噬细胞作用于肺癌的分子机制可能为通过其分泌的信号分子参与调节细胞因子受体信号通路;通过RT-PCR及ELISA实验验证,愈创醇可抑制M2型巨噬细胞IL-10的RNA表达水平(P<0.05)及分泌水平(P<0.05);Western Blot实验结果显示,愈创醇可抑制共培养条件下肺癌细胞IL-10及p-STAT3蛋白的表达;运用IL-10拮抗剂可明显抑制其下游信号通路分子p-STAT3的表达,同时肺癌细胞上皮间质转化得到逆转;在体内ELISA实验结果显示,愈创醇可降低小鼠外周血IL-10水平(P<0.001),RT-PCR结果显示,愈创醇抑制移植瘤IL-10 RNA表达(P<0.001),Western Blot实验结果显示愈创醇抑制移植瘤IL-10及p-STAT3蛋白表达。结论:1.扶正祛邪方抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长及上皮间质转化过程,抑制M2巨噬细胞表型及功能。2.扶正祛邪方有效组分愈创醇可有效抑制M2巨噬细胞表型及功能,从而阻抑Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长,体外阻抑共培养体系下肺癌增殖、迁移和侵袭。3.IL-10为M2巨噬细胞介导EMT过程的关键信号分子,愈创醇可有效抑制M2巨噬细胞分泌IL-10。4.愈创醇通过抑制M2巨噬细胞阻抑肺癌EMT过程,IL-10/STAT3途径参与信号通路调节。