目的:本实验采用PCR-array方法检测脾气虚证与脾阳虚证模型大鼠小肠组织能量代谢相关基因表达,研究脾气虚证与脾阳虚证大鼠小肠组织内共同变化的能量代谢相关基因并分析其差异表达。选取与能量代谢相关的3种脑肠肽CCK、Ghrelin、VIP,研究其在脾气虚证和脾阳虚证模型大鼠下丘脑及小肠组织中基因及蛋白表达的差异性,并进一步分析c AMP/PKA信号通路在调节脾气虚证与脾阳虚证小肠组织功能程度上的差异性。探讨脾气虚证与脾阳虚证的生物学基础并比较分析证候之间的差异性,以此尝试阐释脾气虚与脾阳虚证候的科学内涵,同时设立四君子汤组、附子理中丸组进行反证,阐明四君子汤及附子理中丸治疗脾气虚证与脾阳虚证的疗效及作用机制。材料与方法:采用随机数字表法将60只SD大鼠分成5组,正常组大鼠20只、脾气虚组大鼠10只(简称气虚组)、脾阳虚组大鼠10只(简称阳虚组)、四君子汤组大鼠10只、附子理中丸组大鼠10只。所有大鼠均于我校动物实验中心适应性饲养1周。正常组大鼠每日自由进食饮水,其余各组大鼠采用饮食不节(过饥过饱)结合劳倦过度(力竭游泳)复合因素复制脾气虚证候模型。大鼠先饱食1d,再禁食2d,均不禁水,3天为一周期,每次饱食后记录进食量,每日35℃-37℃的水温进行力竭游泳。5个周期后脾气虚证模型造模结束并进行模型评价。脾气虚模型大鼠的评价标准:神疲、乏力、皮毛无光泽或枯槁、体重下降。阳虚组和附子理中丸组大鼠在脾气虚证模型基础上加入苦寒泻下的因素(番泻叶)复制脾阳虚模型,两组大鼠每日灌服100%番泻叶水煎剂,早晚各1次,7d后脾阳虚证动物模型造模结束进行模型评价。脾阳虚模型评价标准:脾气虚模型评价标准基础上加入便溏、蜷卧喜扎堆、肛周污秽、体温下降或略有下降。将大鼠外在表现加以量化,采用行为学实验系统观察大鼠5min内的运动距离、运动时间、平均运动速度(运动距离/运动时间)、活动区域、垂直活动次数等指标量化大鼠神疲的症状;采用大小鼠抓力测定仪检测大鼠前肢抓力量化大鼠乏力的症状;检测大鼠大便含水量用以量化大鼠便软或溏;依据记录的体温数据量化蜷卧喜扎堆、体温下降等表现;观察各组大鼠进食量、体重数据变化情况;观察大鼠皮毛状态确定其枯槁或有无光泽程度。依据《中医实验动物模型方法学》中记载脾气虚及脾阳虚模型评定标准确定造模成功后,正常组大鼠继续常规饲养,脾气虚组、脾阳虚组给予等量蒸馏水灌胃,四君子汤组每日灌服四君子丸悬浮液(100g大鼠每日用药量为0.375g),每日1次,连续1周,附子理中丸组每日灌服附子理中丸混悬液(100g大鼠每日用药量为0.15g),方法同上。治疗结束后,各组大鼠禁食、自由饮水24小时,大鼠称重,10%水合氯醛腹腔麻醉(3ml/kg体重)。大鼠麻醉后固定于鼠台上,用0.5%碘伏消毒大鼠腹部及颈部皮肤,剪开皮肤及腹膜,取小肠组织用PBS溶液清洗,断头取下丘脑,标本经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。采用PCR-array方法检测各组大鼠小肠组织能量代谢相关基因;Elisa方法检测大鼠小肠组织ATP、c AMP、CCK、Ghrelin、VIP含量;Q-PCR方法检测小肠及下丘脑组织PKA、Ghrelin、Ghrelin受体、CCK、CCK受体、VIP、VIP受体的基因表达。Western Blot方法检测小肠组织PKA的蛋白表达。PCR array数据统计在QIAGEN公司提供的PCR array网站上进行统计学分析,通过2-△△Ct计算组间基因的表达差异。倍数≥2或倍数≤0.5表示差异具有统计学意义。实验数据采用spss19.0统计软件对实验数据进行分析,数据经过正态性检验及方差齐性检验,再进行单因素方差分析。结果以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05认为有统计学差异。结果:1.“脾气虚”、“脾阳虚”大鼠小肠组织能量代谢相关基因差异性研究统计结果显示:与正常组相比,脾气虚组相关能量代谢基因表达差异具有统计学意义的基因共49个,其中基因表达2倍上调基因共10个;基因表达2倍下调基因共39个;脾阳虚组相关能量代谢基因表达差异具有统计学意义的基因共38个,其中基因表达2倍上调基因共13个;基因表达2倍下调基因共25个。与脾气虚组相比,四君子汤组相关能量代谢基因表达差异具有统计学意义的基因共45个,其中基因表达2倍上调基因共27个;基因表达2倍下调基因共18个。与脾气虚组相比,脾阳虚组相关能量代谢基因表达差异具有统计学意义的基因共48个,其中表达增高2倍差异的基因共33个;表达降低2倍差异的基因共15个。2.“脾气虚”、“脾阳虚”大鼠脑肠肽含量及其受体m RNA的研究2.1各组大鼠CCK及其受体的基因表达统计结果显示:与正常组比较,气虚组与阳虚组大鼠小肠组织CCK含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑CCK及其受体的m RNA表达上调(P<0.05);与气虚组比较,阳虚组大鼠小肠CCK含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑CCK及其受体的m RNA表达上调(P<0.05);四君子汤组小肠CCK含量下降(P<0.05),小肠及下丘脑CCK及其受体的m RNA表达下调(P<0.05);与阳虚组比较,附子理中丸组小肠CCK含量降低(P<0.05),小肠及下丘脑CCK及其受体的m RNA表达下调(P<0.05)。2.2各组大鼠Ghrelin及其受体的表达变化统计结果显示:与正常组比较,气虚组与阳虚组大鼠小肠Ghrelin含量下降(P<0.05),小肠及下丘脑Ghrelin及其受体的m RNA表达下调(P<0.05);与气虚组比较,阳虚组大鼠小肠Ghrelin含量下降(P<0.05),小肠及下丘脑Ghrelin及其受体的m RNA表达下调(P<0.05);四君子汤组小肠Ghrelin含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑Ghrelin及其受体的m RNA表达上调(P<0.05);与阳虚组比较,附子理中丸组小肠Ghrelin含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑Ghrelin及其受体的m RNA表达上调(P<0.05)。2.3各组大鼠VIP及其受体的表达变化统计结果显示:与正常组大鼠比较,气虚组与阳虚组大鼠小肠VIP含量下降(P<0.05),小肠及下丘脑VIP及其受体的m RNA表达下调(P<0.05);与气虚组比较,阳虚组大鼠小肠VIP含量下降(P<0.05),小肠及下丘脑VIP及其受体的m RNA表达下调(P<0.05);四君子汤组VIP含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑VIP及其受体的m RNA表达上调(P<0.05);与阳虚组比较,附子理中丸组VIP含量升高(P<0.05),小肠及下丘脑VIP及其受体的m RNA表达上调(P<0.05)。3.“脾气虚”、“脾阳虚”证候模型大鼠小肠c AMP/PKA信号通路变化3.1各组大鼠小肠组织ATP、c AMP含量变化统计结果显示:与正常组相比,气虚组与阳虚组大鼠ATP和c AMP蛋白含量均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与气虚组相比,阳虚组大鼠ATP和c AMP蛋白含量下降,四君子汤组大鼠ATP和c AMP蛋白含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与阳虚组比较,附子理中丸组大鼠ATP和c AMP蛋白含量升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2各组大鼠小肠PKA蛋白及m RNA的表达统计结果显示:与正常组相比,气虚组与阳虚组大鼠PKA蛋白和m RNA表达均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与气虚组相比,阳虚组大鼠PKA蛋白和m RNA表达下降,四君子汤组大鼠PKA蛋白和m RNA表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与阳虚组比较,附子理中丸组大鼠PKA蛋白和m RNA表达升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.脾气虚与脾阳虚大鼠证候差异性与相关能量代谢基因表达密切相关。2.脾阳虚证模型大鼠下丘脑及小肠组织CCK、VIP、Ghelin等脑肠肽的表达水平较脾气虚证模型大鼠改变更为显著,体现了脾阳虚与脾气虚证候在介导c AMP/PKA信号通路调节能量代谢程度上存在着差异性。3.四君子汤治疗脾气虚证与附子理中丸治疗脾阳虚证与通过CCK、VIP、Ghelin等脑肠肽表达调控c AMP/PKA通路功能密切相关。4.脾气虚证与脾阳虚证下丘脑及小肠组织CCK、VIP、Ghelin等脑肠肽表达差异性及c AMP/PKA通路调控作用程度是二者证候差异性的生物学基础。
