基质金属蛋白酶8基因治疗大鼠肝硬化的实验研究

目的:Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝细胞外过度沉积是肝纤维化、肝硬化形成的一个重要特征。然而,到目前为止仍没有一种有效地治愈肝纤维化、肝硬化的方法。中性粒细胞胶原酶(MMP-8)能够特异的降解Ⅰ型胶原,把MMP-8基因导入肝细胞将有可能是降解胶原纤维有效的方法。本研究通过构建一种能够表达MMP-8的腺病毒,治疗肝硬化的大鼠,探讨其能否有效地降解胶原,减轻肝脏的纤维化程度。 方法:以质粒pGW1GH-MMP8为模板,应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶切重组技术克隆了全长的MMP-8基因(pro-MMP8)及其截短的MMP-8基因(tMMP-8)片段,构建了复制缺损性腺病毒载体携带乙肝病毒(HBV)载体表达MMP-8基因的质粒pDC-CH-tMMP8、pDC-C-MMP8,经酶切鉴定正确后进行质粒的大量提取,并用同样的方法制备对照质粒pDC-CH-RFP2,构建的质粒与腺病毒骨架质粒pBHGLox△E1,3Cre共转染293细胞以包装、扩增重组腺病毒。在动物实验中,以3×1011病毒颗粒尾静脉注射治疗硫代乙酰胺诱导的肝硬化大鼠模型,分别于2周、4周后处死动物,0.3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,收集血清保存于-70℃,做肝功能、肝纤四项等检查,分离肝组织,部分用10%的福尔马林固定,进行组织病理学检查,其余-70℃保存备用。 结果:成功构建了表达MMP-8基因的腺病毒Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8,并运用于治疗肝硬化大鼠的研究。在Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8尾静脉注射肝硬化大鼠的体内转染研究中,转染2周后相比于模型组和阴性对照组,肝纤维化程度减轻。HE染色及天狼猩红染色结果显示治疗组肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死及炎症细胞浸润均有减轻,可见不同程度的肝细胞再生,胶原纤维条索变细变窄,肝小叶结构恢复,与模型组及阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05);羟脯氨酸含量测定结果显示与模型组相比,治疗组肝组织羟脯氨酸含量有所下降(28.97±2.36 VS 17.04±0.61、17.62±1.30),具有统计学上的差异(P<0.05),而Ad-CH-RFP2组较模型组又有所升高(30.89±3.67);血清ALT测定结果显示治疗组、阴性对照组大鼠ALT升高,显著高于正常组和模型组(P<0.05),然而,与正常组、模型组、阴性对照组相比,治疗组血清总胆红素、血清白蛋白没有显著的变化,无统计学差异(P>0.05)。转染4周,治疗组大鼠肝纤维化程度继续减轻。而在Ad-CH-RFP2对照组,纤维化程度同模型组类似,并未减轻。 结论:实验研究结果表明,MMP-8能够有效地降解Ⅰ型胶原,减轻大鼠肝纤维化程度。这一创新,有望把MMP-8基因治疗肝硬化带入临床应用,开辟肝硬化软肝治疗新途径。