蜡梅开花过程基因表达的ESTs分析与凝集素基因功能的初步鉴定

蜡梅(Chimonanthus praecox （L．） Link)是蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus Lindl．）植物，为原产我国的落叶丛生灌木。蜡梅花在12月至翌年早春2月孕蕾开花、花香宜人以及其特殊的抗逆性状令人关注。目前人们对蜡梅开花与花香形成的分子机理研究缺乏，没有从蜡梅中克隆到抗逆基因的报道，对蜡梅开花过程中的基因表达情况不清楚。本论文从构建蜡梅花cDNA文库入手，利用EST技术分析开花过程中的基因表达情况，在此基础上，克隆蜡梅凝集素基因，利用转基因手段初步分析其抗虫性。主要取得以下结果： 1．蜡梅花cDNA文库构建 用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了蕾期、露瓣期、初开期、盛开期蜡梅花混合cDNA文库。原始文库滴度达到1.4×10～6pfu／ml，扩增文库滴度约为1010pfu／ml，重组率达96％，插入片段在0.5 kb以上，平均约1.1kb。通过PCR检测，从扩增文库中检测到了蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强。LTP基因具有内含子，而通过PCR从文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染。这是第一次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。 2．蜡梅花EST序列测定与拼接 从蜡梅花cDNA文库首先挑取噬菌斑克隆，然后转变为质粒，PCR筛选阳性克隆进行正向序列测定获得了896个原始序列，经SeqMan、BLAST分析后得到蜡梅花的有效EST序列867条，有效率为96.76％。全部片段长为584201bp，平均读长为673.8bp。进而转化成GenBank提交格式提交GenBank数据库，登录号从DW222667到DW223533。 利用DNASTAR软件包的SeqMan Ⅱ程序对867条有效EST序列进行序列拼接后得到479个不同的独立基因（contigs，含singlet），冗余序列占全部序列的44.8％。 根据不同独立基因（contigs，含singlet）的EST数量统计，蜡梅开花过程低丰度表达