白头翁皂苷D抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG及U251MG生长的实验研究

近年来天然植物提取物单体在抗肿瘤增殖和促肿瘤凋亡方面取得了一系列进展，以其对正常细胞细胞毒性小，对恶性肿瘤细胞毒性大和促凋亡而备受青睐。白头翁皂苷D存在于自然界多种植物内。本实验主要针对白头翁皂苷D对恶性胶质母细胞系U87MG和U251MG的生长抑制作用和促凋亡作用及机制展开研究，共分为两个部分: 第一部分：研究在体外白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对人源性胶质母细胞瘤系U87MG及U251MG的生长抑制和促凋亡作用及其主要机制 目的：以人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG为对象，研究白头翁皂苷D（即盲测试剂太白银莲花W-6单体）抑制其生长及致凋亡的作用机理，为治疗恶性胶质瘤药物的研究和开发利用提供进一步的依据。 方法： 1.采用噻唑蓝（MTT）比色法研究白头翁皂苷D对胶质瘤细胞的增殖抑制作用：以正常人静脉内皮细胞系EVC304以及人脑正常星形胶质细胞为阳性对照组，U87MG和U251MG作为实验组，每组中各设自身阴性对照组；在等比浓度梯度(0.219nmol/ml、0.438nmol/ml、0.876nmol/ml、1.752nmol/ml、3.504nmol/ml、7.008nmol/ml、14.016nmol/ml and28.032nmol/ml)下，用白头翁皂苷D，分别作用于人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG，在24小时和72小时检验其增殖抑制作用。同时求得白头翁皂苷D对U87MG及U251MG的IC25、IC50及IC75值；以同样的浓度梯度检测其对EVC304以及人脑正常星形胶质细胞的增殖抑制情况； 2.采用流式细胞检测技术检测凋亡作用：在经MTT实验求得IC25、IC50及IC75浓度的基础上，用白头翁皂苷D分别作用U87MG和U251MG，经12小时和16小时后送检，检测细胞的凋亡现象及其细胞周期变化； 3.形态学观察凋亡现象：用IC25、IC50及IC75浓度的白头翁皂苷D分别处理U87MG和U251MG细胞6小时、12小时、24小时后，采用Hoshest33342染色剂浸染15分钟，观察细胞核形态变化；采用TUNEL/PI法，观察计数其凋亡情况；对经白头翁皂苷D处理的U87MG和U251MG，采用透射电镜法，经固定、包埋、切片处理后行超微结构观察； 4.生化指标检测：选取凋亡蛋白Caspase家族中的重要成员Caspase-3、Caspase-8，以及其上游的Fas/Fas-L及线粒体Bcl-2/Bax作为检测指标，研究相关蛋白表达水平变化，初步探究其致凋亡机制；检测自噬特异性抗微管相关蛋白LC-3表达水平来验证药物对肿瘤细胞发生自噬现象的诱导作用。 5.DNA碎片检测：按IC50和IC75的浓度，用头翁皂苷D处理U87MG及U251MG细胞，分别经12小时和16小时后，用PBS洗脱，Tris–HCl溶解细胞，20mMEDTA和0.2%Triton-X100在4℃静置30min，套管离心，washing-buffer进行洗涤，洗脱液洗脱并提取样品，后在加有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳。 结果： 1.MTT实验后，统计数据，发现白头翁皂苷D对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG增殖具有显著的抑制作用；在白头翁皂苷D浓度为14.016nmol/ml时，对U87MG和U251MG的抑制率分别为87.423%和94.034%(n=6, p<0.05)；并求得白头翁皂苷D对U87MG和U251MG的IC50值分别为7.018nmol/ml和10.132nmol/ml；而药物对EVC304和正常胶质细胞其生长抑制作用并不显著； 2.经FITC-Annexin V/PI染料染色、流式细胞仪检测后，发现在不同浓度下用白头翁皂苷D分别处理U87MG和U251MG12小时和16小时后，早期凋亡和中晚期凋亡呈明显增加：其中，U87MG的中晚期凋亡率由对照的1.5%增加到57%,其早期凋亡率由0.2%增加到25.8%，凋亡增加显著；U251MG的同样增加显著；周期检测，U87MG和U251MG样品都出现SubG1峰，并呈明显梯度变化趋势；且细胞周期阻滞在G0/G1期； 3.药物处理组经Hoshest33342染色后，在荧光显微镜下，可明显观察到处理组细胞核呈新月形、车轮状等典型凋亡特征，并随着浓度增高和时间延长，细胞核破碎并呈点状分布；而对照组和EVC304组未见明显核型异常；在电镜下观察细胞，可见早期凋亡细胞细胞质浓缩，染色质浓聚和边集，可形成新月形小体，随后可见核裂解，有凋亡小体形成，同时我们发现了疑似自噬小体的存在；经TUNEL/PI染色后，可见凋亡细胞呈橘黄色，而未凋亡或者死亡细胞则为红色； 4.在凋亡生化指标检测中，用免疫印迹实验检测相关蛋白，发现Caspase-3、Caspase-8表达随着药物作用的时间和浓度的增加而升高，Fas/Fas-L表达也随之升高，Bcl-2的表达变化降低， Bax表达随着药物作用的时间和浓度的变化增加；LC-3Ⅱ/LC-Ⅰ灰度比值随着药物浓度的增加显著升高； 5.用DNA ladder法检测DNA碎片，可见在IC50和IC75组出现典型梯状条带，而对照组未见明显断裂条带。 第二部分：白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对荷瘤小鼠模型胶质瘤生长抑制的作用研究 目的：研究在体内情况下，白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对于构建的胶质瘤动物模型中肿瘤的生长抑制和促凋亡作用。 方法： 1.进行荷瘤载体造模：选择15g～18g的9只雄性昆明小鼠，以鼠胶质细胞瘤细胞系G422行皮下注射进行造模，14天后观察肿瘤生长情况；检测体重，按空白组、安慰剂组、给药组，进行随机匹配分组；后按体重0.0056mg/g行腹腔注射给药，7天后进行观察；相同方案下，选择3～4周雄性裸鼠以U87MG细胞进行造模，后统计分析； 2.用HE染色和TUNEL法检测给药处理后肿瘤标本，观察并统计其凋亡情况；并送电镜检测其微观结构变化。 结果： 1.进行荷瘤载体研究，并分析给药组肿瘤生长情况，发现给药组肿瘤平均重量较空白组和安慰剂组均显著减轻且与给药浓度成反比； 2.经药物处理后的肿瘤经HE染色，可见细胞核深染，胞核着色明显，TUNEL/PI染色后可见明显黄染区；电镜可见肿瘤核型明显浓聚，胞浆皱缩。 结论： 1.白头翁皂苷D明显对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG有抑制增殖作用，且呈时间和浓度依赖； 2.体内体外实验证实白头翁皂苷D对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG有较强致凋亡作用，使细胞周期阻滞在G0/G1期；且其致凋亡主要通过肿瘤坏死因子受体途径和线粒体途径介导； 3.初步研究发现白头翁皂苷D可诱导U87MG及U251MG细胞发生自噬。