miR-24-3p对泪腺腺样囊性癌恶性生物学行为的作用与机制研究

目的:泪腺腺样囊性癌(lacrimal adenoid cystic carcinoma)是泪腺最常见的恶性上皮性肿瘤,其发生率仅次于泪腺多形性腺瘤。泪腺腺样囊性癌有高度恶性,早期难发现,易复发,嗜神经侵袭,易远处转移的特点,这些特点和复杂的眼眶解剖学结构导致癌症早期切除和完全切除是很困难的。这也是泪腺腺样囊性癌预后差的主要原因。大量研究证实mi RNAs调控多种癌症的发生、发展、侵袭和转移。mi RNAs对泪腺腺样囊性癌的恶性生物学行为的影响及其具体机制尚不明确。mi RNAs是一类大小约为22nt的非编码小RNA,其可在转录后水平调控相应基因的表达。mi RNAs可通过调控多种基因的表达,既包括癌基因也包括抑癌基因,进而影响腺样囊性癌细胞的生物学功能,包括细胞活性,增殖,迁移和侵袭能力等。本课题着重研究mi RNAs对泪腺腺样囊性癌生物学行为的影响及其具体机制,为腺样囊性癌的治疗提出可能的新靶点。方法:首先通过基因芯片技术和qRT-PCR发现在泪腺腺样囊性癌组织中,相较于正常组织,存在差异表达的mi RNAs。在这些mi RNAs中选择mi R-24-3p作为研究对象;首先我们构建了mi R-24-3p的过表达质粒,合成了封闭质粒ASO-mi R-24-3p,检测mi R-24-3p对腺样囊性癌细胞生物学行为的影响,包括MTT实验检测mi R-24-3p对腺样囊性癌细胞活性的影响,克隆形成实验检测mi R-24-3p对体外增殖的影响,以及Transwell迁移和侵袭实验检测mi R-24-3p对癌细胞迁移、侵袭的影响。通过FACS和western blot实验验证mi R-24-3p对腺样囊性癌细胞凋亡和EMT过程的影响。通过生物学软件预测相应靶基因,并通过以上实验方法研究靶基因对腺样囊性癌细胞的影响。接下来通过挽救实验证实mi R-24-3p通过直接作用于靶基因来调控腺样囊性癌的生物学行为。靶基因被确定参与p53/p21信号通路,证实了mi R-24-3p可通过影响靶基因的表达来调控p53/p21信号通路。结果:通过基因芯片技术和实时定量PCR发现在泪腺腺样囊性癌中,miR-24-3p在癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,且在高转移细胞株ACC-M中的表达明显低于低转移细胞株ACC-2。对腺样囊性癌细胞恶性生物学行为的研究中发现,mi R-24-3p抑制腺样囊性癌细胞的生长活性,增殖,迁移和侵袭,促进细胞凋亡,抑制上皮间质转化(EMT)过程。通过生物学信息预测相关的靶基因,绿色荧光EGFP报告载体和western blot实验确定PRKCH是mi R-24-3p的直接靶基因,mi R-24-3p与PRKCH 3’UTR端结合后下调其表达;实时定量PCR和western blot实验证明mi R-24-3p可以对内源性靶基因PRKCH的表达产生抑制。靶基因PRKCH可促进腺样囊性癌细胞的恶性生物学行为,挽救实验证实靶基因PRKCH可逆转mi R-24-3p对腺样囊性癌的抑制作用。进一步利用实时定量PCR和western blot实验证实mi R-24-3p通过调控靶基因的表达参与p53/p21信号通路。结论:mi R-24-3p抑制腺样囊性癌细胞的细胞活性、增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为,起着抑癌基因的作用。该抑癌作用至少部分是通过靶定基因PRKCH,下调基因PRKCH的表达来实现的。实验进一步证实PRKCH可负性调控p53/p21信号通路,而mi R-24-3p通过靶基因PRKCH参与p53/p21信号通路的调控。