萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因PCR定点突变及在E.coli中的表达

萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2是从萝卜（Raphanus sativus）种子中分离到的一 种6KD富含半胱氨酸的抗真菌蛋白（RaPhnus sativus-antifingal protein）。其 cDNA全长有243bp，共编码80个氨基酸。它的N端的29个氨基酸为信号肽， 余下的51个氨基酸为成熟肽。 本研究根据Rs-AFP2基因的序列，结合基因及其表达调控中遗传密码的偏 爱性，人工合成了7条引物。利用PCR重叠延伸技术，把萝卜抗真菌蛋白 Rs-AFP2基因的编码序列第9号氨基酸Arg密码AGG改为细菌偏爱密码CGA， 同时对编码序列起始区的部分核苷酸进行突变，又采用嵌套PCR，迅速地克隆 到目的基因。将之插入pGEM-5Zf/EcoRV-T easy克隆载体，得到重组质粒 pGEM-Tm。用其转化宿主菌XL1，筛选阳性菌落。通过重组质粒的PCR鉴定、 双酶切及全序列测定，其结果表明已完成了对该基因的改造。 为了除去cDNA上29个氨基酸信号肽编码区，重新合成了2条上游PCR 引物，5'端具有NdeⅠ识别位点，并分别与原Rs-AFP2基因和突变后Rs-AFPm 基因的序列互补，与上游引物匹配的是原PCR反应的下游引物（5'端具XhoⅠ 位点）。以含Rs-AFP2和Rs-AFPm基因的克隆载体为模板，扩增Rs-AFP2和 Rs-AFPm成熟肽的编码序列。PCR产物经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，插入 pET-2lb，构建成不带信号肽的非融合表达载体pETAFPo和pETAFPm。 将表达载体分别导入E.coli BL21，经IPTG诱导，Rs-AFP2和Rs-AFPm基 因均得到表达。表达产物经低分子量蛋白质电泳系统检测，在6KD左右位置上 出现了一条空白载体受体菌缺乏的表达蛋白带。该表达蛋白以包含体的形式存 在于细胞中。 体外抑菌实验表明，Rs-AFPm表达产物的抑菌活性明显高于Rs-AFP2表达 产物的抑菌活性。这说明突变后的基因有效地提高了表达效率。