D-二聚体单克隆抗体制备及荧光胶乳免疫层析应用的研究

D-二聚体是人体内纤维蛋白降解的特异性产物，血液中D-二聚体的含量反应了人体内血栓的形成及溶解状态，D-二聚体的含量测定对血栓性疾病的检测及监控有指导性作用。D-二聚体的检测试剂主要应用抗D-二聚体单克隆抗体与D-二聚体抗原的免疫反应，定性或定量检测D-二聚体。抗D-二聚体单克隆抗体是各种检测试剂的生物原材料，抗体的性质直接影响试剂检测结果的准确性和可靠性。故特异性强的抗D-二聚体单克隆抗体的制备是开发各类D-二聚体检测试剂的关键。国内外多利用传统杂交瘤细胞筛选方法或基因工程方法制备抗D-二聚体单克隆抗体，主要应用于D-二聚体酶联免疫检测试剂（其中包括微孔板ELISA、免疫荧光ELISA、化学发光ELISA）以及用于胶体金免疫层析试剂、半定量乳胶凝集试剂、全血凝集试剂和免疫比浊试剂。 本试验以D-二聚体为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠；首先利用甲基纤维素半固体基改进的传统杂交瘤技术，筛选出了141株杂交瘤细胞株；接着应用D-二聚体、纤维蛋白原、纤维蛋白、及纤维蛋白降解物为筛选原料，利用间接ELISA筛选技术从141株杂交瘤细胞株中筛选出10株稳定的阳性杂交瘤细胞株；最后通过单克隆抗体体外生产法，生产10株抗D-二聚体的单克隆抗体，分别命名为1-3C、2-1B、2-1D、2-4B、2-6D、4-1D、4-3C、4-3D、4-4C、5-3B。ELISA检测结果表明，10株单克隆抗体腹水效价可达1×10～6。抗体类—亚类—型鉴定结果显示，抗体型为IgG1的有2-1D，为IgG2a有1-3C、2-1B、2-4B、4-3C、4-3D，为IgG2b有2-6D、4-1D、4-4C、5-3B。Westernblot结果表明与纤维蛋白原有交叉抗体有4-1D、5-3B，与纤维蛋白原降解物有交叉的抗体有C1、C2，只与D-二聚体有反应而无交叉的抗体有1-3C、2-1B、2-6D、4-3C、4-3D、4-4C。通过双抗夹心ELISA方法进行单克隆抗体的配对，结果显示15对配对显示阳性结果。最后依次采用ELISA、胶体金及荧光胶乳定量法筛选出适用于荧光定量法的2-6D与C2抗体对。 荧光胶乳免疫层析法是一种快速免疫学方法，具有简便快捷，敏感特异的优点。本试验利用配对的D-二聚体单克隆抗体，制备荧光胶乳免疫层析试纸条，并将其应用于荧光定量检测仪（广州万孚生物技术有限公司）。敏感性结果表明，本试验制备的荧光胶乳试纸条可以敏锐的检测出含量仅为100μg/L浓度的D-二聚体；在特异性试验中没有交叉，通过临床试验对医院样品进行检测，结果显示阳性符合率92.1%，阴性符合率更高达98%。 本研究结果表明，改进的杂交瘤细胞筛选方法制备出的抗D-二聚体单克隆抗体亲和性和特异性好。通过双抗夹心ELISA法-胶体金法筛选出的抗体对应用于免疫荧光胶乳定量层析法具有高的敏感性和特异性，可达到与国外同类试剂盒相同的效果。该研究成果为我国血栓类疾病的检测、监控和治疗提供了有效的技术支持。