中药治疗大肠癌术后脾肾阳虚证患者疗效及对肠道菌群影响的研究

研究背景及目的大肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是临床上常见的消化道恶性肿瘤,它的发病率和死亡率在恶性肿瘤病例中一直都居高不下。临床上治疗CRC以外科手术为主要方法之一,辅以化疗、放疗和中医药治疗等,其中手术最为广泛且疗效更确切。近年来越来越多的研究报道肠道微生物与CRC之间存在着密切的关联,手术治疗也会明显改变患者的肠道微生态,术后出现的一系列并发症也与肠道菌群的结构改变有关。中医药治疗往往能减轻患者术后相关临床症状,改善生活质量,具有良好的疗效。且近来研究发现中医药与肠道菌群之间也存在着密切的联系。经过临床观察以及文献研究发现临床上不少CRC术后患者中医辨证属于脾肾阳虚证,采用中药干预后临床效果突出。本研究拟探讨中药干预CRC术后脾肾阳虚证患者的相关症状变化情况,以及采用第二代高通量测序技术对患者中药干预前后的肠道菌群结构进行分析,并与正常健康人群的肠道菌群结构作比较,以期找到CRC术后脾肾阳虚证患者肠道菌群的变化,证明中药干预在改善患者相关症状的同时能够改善CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道微生态,进一步说明中药干预的疗效与肠道微生态之间具有相关性。并尝试找出肠道菌群中与CRC治疗有关的有益菌、有害菌和关键菌,从而为中医药抗肿瘤的研究提供新证据、新方法。研究方法本研究共纳入2018年1月至2020年12月于北京中医药大学东方医院门诊及住院治疗的CRC术后脾肾阳虚证患者共40例,采用前瞻性自身前后对照试验,使用中药制剂持续干预2周,对患者中药干预前后的相关症状和体征通过症状积分法进行评价,分析中药干预对CRC术后脾肾阳虚证患者的疗效。对40名患者用药前后以及10名正常健康人共90份粪便标本进行采集,然后使用16S rDNA测序技术分别检测出健康正常志愿者（作为研究基线）、CRC术后脾肾阳虚证患者以及中药干预后的CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群信息,然后进行一系列深入的群落结构的统计学及可视化分析比较三组样本肠道菌群结构的变化,得到CRC术后脾肾阳虚证患者肠道菌群的特殊变化,证明中药干预CRC术后脾肾阳虚证患者的疗效及与肠道菌群的关系,并尝试找出肠道菌群中与CRC治疗有关的有益菌、有害菌及关键菌。研究结果1.40名CRC术后脾肾阳虚证患者中药干预后评价为痊愈者2名,显效者16名,有效者22名,无效者0名,中医症状改善的有效率为100%。其中中药干预前中医症状总积分为13.65±2.65,中药干预1周后为9.00±2.15,中药干预2周后为4.58±2.29。三个时间点互相两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。说明采用中药干预CRC术后脾肾阳虚证患者后的相关症状获得了明显的改善。2.OTU分类鉴定结果显示中药干预前后CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群的结构具有一定的相似性,但也存在一定的差异性,中药干预在改善患者相关症状的同时使患者的肠道微生物多样性增加,具有比干预前有更多样的肠道微生物。3.Alpha多样性分析结果显示正常健康人的肠道微生物群落的丰富度和多样性均高于CRC术后脾肾阳虚证患者,而中药干预使CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道微生物群落的丰富度和多样性较用药前有一定程度的升高,使之接近于正常健康人群。4.Beta多样性分析结果显示CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群与正常健康人相比存在显著差异,处于失调状态,而中药干预使患者的肠道菌群微生态得到改善,且中药干预后患者的肠道菌群组内差异性变小,说明中药干预CRC术后患者能改善其肠道微生态。5.CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群组成和相对丰度与正常健康者相比无显著（P<0.05）减少物种,CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群组成和相对丰度与正常健康者相比存在显著增高（P<0.05）的物种,尤其是克雷伯氏菌属（gKlebsiella）、埃希氏菌属（gEscherichia）、gLachnoclostridium菌。可见CRC术后脾肾阳虚证患者肠道菌群失调的主要问题是共生菌和致病菌失衡,条件致病菌异常增多,这与CRC术后脾肾阳虚患者出现的相关症状具有相关性。6.中药干预前后CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群的结构在门、纲、目、科、属水平上均发生了改变,CRC术后脾肾阳虚证患者中药干预后组成和相对丰度存在显著减少（P<0.05）的物种,尤其是gLachnoclostridium、埃希氏菌属（gEscherichia）、克雷伯氏菌属（gKlebsiella）、肠球菌属（gEnterococcus）。CRC术后脾肾阳虚证患者中药干预后组成和相对丰度显著增多（P<0.05）的物种普雷沃氏菌科（fPrevotellaceae）,尤其是 gPrevotella9、柔嫩梭菌属（gFaecalibacterium）、罗姆布茨菌（gRombotusia）。中药干预能抑制CRC术后脾肾阳虚证患者肠道微生物中条件致病菌的生长,促进有益菌的生长,这与中药干预改善了 CRC术后脾肾阳虚证患者的相关症状具有相关性。7.本研究通过组成及丰度检测发现在不同组别存在某些特定菌,这些物种可以作为监测不同治疗阶段的疾病活动性和治疗反应性的指标。CRC术后脾肾阳虚证患者组区别于别组的特定菌为乳杆菌目（oLactobacillales）、克雷伯氏菌属（gKlebsiella）、gRuminococcusgnavusgroup,中药干预后组为:罗姆布茨菌（gRombotusia）、gAnaerostipes,中药干预前组为乳杆菌目（oLactobacillales）、克雷伯氏菌属（gKlebsiella）、gRuminococcusgnavusgroup,正常健康组为巨单胞菌属（gMegamonas）、柔嫩梭菌属（gFaecalibacterium）、gSubdoligranulum、gEnorma、gRoseburia、gAlistipes、萨特氏菌属（gSutterella）、gRuminococcaceaeUCG002。8.在人体肠道微生物所有样本绝对丰度前20的属水平范围内,本研究发现不存在相互拮抗的菌群,而gPrevotella9和巨单胞菌属（gMegamonas）之间均存在相互协同作用。研究结论本研究证实了CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道菌群结构与正常健康人相比处于失调状态,CRC术后脾肾阳虚证患者肠道菌群失调的主要问题是共生菌和致病菌失衡,致病菌异常增多,这与CRC术后脾肾阳虚患者出现的相关症状具有相关性。中药干预可以改善术后患者相关症状,改善患者生活质量。同时还发现中药干预能够能抑制有害菌的生长,促进有益菌的生长,主要使普雷沃氏菌科（fPrevotellaceae）的相对丰富度增加,而肠杆菌科（fenterobacteriaceae）、肠球菌科（fEnterococcaceae）的相对丰富度减少,改善了 CRC术后脾肾阳虚证患者的肠道微生态,使肠道微生物群落的丰富程度和多样性增加,有助于CRC术后患者肠道菌群结构恢复正常健康状态,这与中药干预改善了 CRC术后脾肾阳虚证患者的相关症状具有相关性。并且CRC术后脾肾阳虚证中药干预前后的患者和正常健康者的肠道菌群均有其特定的关键菌。中药干预改善CRC术后脾肾阳虚证患者相关症状的作用机制与其改善患者的肠道微生态有关。