四逆汤有效组分配伍对甲状腺功能减退症的治疗作用及其机制研究

目的：研究以有效组分配伍形式的四逆汤对甲减大鼠甲状腺功能及常见并发症的治疗作用,并阐明其作用机制以揭示四逆汤有效组分配伍治疗甲减的科学内涵。方法：1.四逆汤有效组分配伍治疗甲减的药效学研究采用化学诱导法(灌胃0.1%PTU)制成脾肾阳虚型甲减模型大鼠,以甲状腺激素水平及甲状腺病理变化为指标,观察组分配伍四逆汤对甲减动物甲状腺功能的影响；以脑组织凋亡因子BAX、BCL-2及脑组织内单胺类递质DA、5-HT、N A的含量为指标,观察组分配伍四逆汤对甲减并发脑损伤的影响；以血清TG、TC及LDH-L为指标,观察组分配伍四逆汤对甲减并发高血脂的影响；以血清BUN、CREA、Cys-C及肾脏病理为指标,观察组分配伍四逆汤对甲减并发肾损伤的影响；以血清ANP、ET及心肌组织Na+-K+-ATP酶的活力为指标,观察组分配伍四逆汤对甲减心血管系统的影响,同时观察药物对动物一般情况的影响。2.四逆汤有效组分配伍治疗甲减的作用机制研究用放射免疫测定血清TRH、TSH、 T3及T4含量以研究四逆汤有效组分配伍对甲减动物下丘脑-甲状腺轴的影响,测定血清ACTH.CRO T含量以研究四逆汤有效组分配伍对甲减动物下丘脑-肾上腺轴的影响,通过以上研究说明四逆汤有效组分配伍治疗甲减的神经内分泌机制；测定血清TPO、TPO-Ab、Tg、Tg-Ab、TR-Ab TAM-Ab、IL-1及TGF-β1含量以说明其治疗甲减的免疫机制；用荧光定量PCR法研究其对钠-碘共转运体(NIS)表达的影响,用酶联免疫法测定甲状腺组织中甲状腺转录因子-1、cAMP、PKA水平,以明确四逆汤有效组分配伍对调控甲状腺功能的分子机制。3.组分配伍四逆汤治疗甲减的蛋白质组学研究采用二维凝胶电泳技术分离各组动物血清蛋白质,并用PDquese 8.0软件分析进行差异点分析结果：1.四逆汤有效组分配伍治疗甲减药效学研究动物一般状态：0.1%PTU可形成甲减脾肾阳虚证的表现,如毛发枯黄、倦怠嗜卧、便质稀等,经四逆汤有效组分配伍治疗四周可改善以上症状。甲状腺激素水平及甲状腺病理形态：与空白对照组比较,模型组大鼠血清T3、T4水平明显降低,TSH水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比较,四逆汤各剂量组大鼠血清中T3、T4水平均有所升高,TSH水平显著降低,其中中剂量组作用效果显著(P<0.05)。病理结果显示：与空白对照组相比,模型组肉眼观察可见甲状腺明显肿大,镜下观察甲状腺组织呈结节状分布,组织内血管增多,滤泡上皮细胞肥大,部分滤泡融合形成巨大滤泡。四逆汤有效组分配伍各剂量组与模型对照组比较,肉眼观察甲状腺肿大程度亦有所减轻,镜下观察四逆汤有效组分配伍高、中剂量组未见明显血管增多现象,腺细胞肿大程度亦有所减轻。甲减并发脑损伤：各组见脑组织凋亡因子BAX、BCL-2含量无显著差异；与空白对照组相比,模型组动物脑内兴奋性神经递质NA和DA浓度降低,抑制性神经递质5-HT浓度升高,均具有显著差异；四逆汤有效组分配伍各剂量组及阳性药物可不同程度地增加脑内NA和DA浓度,降低5-HT浓度,具有统计学差异。甲减并发肾损伤：与空白对照组相比,模型组动物BUN、CREA及Cys-C等水平升高显著,并见一定程度的病理损害；四逆汤有效组分配伍组可降低甲减肾损伤引起的BUN、CREA及Cys-C等的升高(P<0.05),并减轻肾脏病理损害。甲减并发高血脂：与空白组相比,模型组的TG、TC及LDH-L明显升高；与模型组相比,四逆汤有效组分配伍组的TG、TC及LDH-L明显减少(P<0.05)。甲减并发心血管损害：与空白组比较,模型组及各药物治疗组血清ANP、ET水平及心脏组织Na+-K+-ATP酶显著降低(P<0.01),与模型组相比,四逆汤有效组分配伍各治疗组ANP水平显著升高(P<0.01),四逆汤有效组分配伍高剂量组可升高血清ET水平,四逆汤有效组分配伍各治疗组对心脏组织Na+-K+-ATP酶有所升高,但无显著统计学差异。2.四逆汤有效组分配伍治疗甲减的作用机制研究对神经内分泌的调控作用：与空白组相比,模型组血清T3、T4水平显著降低(P<0.01),sTSH、TRH水平显著升高；与模型组比较,四逆汤有效组分配伍组血清T3、T4水平显著升高,sTSH、TRH水平显著降低(P<0.01)。空白对照组相比,模型组血清ACTH、CROT显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比,四逆汤有效组分配伍组血清ACTH、CROT明显降低,具有统计学差异(P<0.05),说明四逆汤有效组分配伍能调节造模引起的下丘脑-甲状腺轴、下丘脑-肾上腺功能紊乱。对自身免疫的调节作用：实验结果表明模型组与空白组作对比,其TPO、TPO-Ab、TAM-Ab、TGF-β1水平明显降低,大鼠胸腺指数和脾脏指数显著降低,(P<0.01)而TG、TG-Ab、TR-Ab、IL-1水平明显升高(P<0.01),说明甲减状态下自身抗原、抗体出现紊乱。四逆汤有效组分配伍组与模型组对比,TPO、TPO-Ab、TAM-Ab、TGF-β1水平明显升高,而TG、TG-Ab、TR-Ab、IL-1水平明显减少,说明四逆汤有效组分配伍在对甲减状态自身免疫系统具有调节作用。对甲状腺激素合成相关基因的调控：与空白组相比,模型组甲状腺组织NISmRNA表达有所降低(P>0.05)；四逆汤有效组分配伍组甲状腺组织NISmRNA表达升高显著(P<0.01)；与模型组比较,四逆汤有效组分配伍组甲状腺组织NISmRNA表达显著升高(P<0.01)。对甲状腺激素合成相关细胞因子的调节作用：甲状腺转录因子-1(TTF-1)：与空白组相比,模型组甲状腺组织TTF-1、PKA、CAMP水平显著升高(P<0.01),四逆汤有效组分配伍组甲状腺组织TTF-1水平升高显著(P<0.01), PKA、cAMP水平升高无显著统计学差异(P>0.05)；与模型组比较,四逆汤有效组分配伍组甲状腺组织TTF-1、PKA水平显著降低(P<0.01),CAMP水平有所降低,但无统计学差异(P>0.05),说明四逆汤有效组分配伍组可调控甲状腺组织TTF-1、PKA表达而影响甲状腺功能。3.组分配伍四逆汤治疗甲减的蛋白质组学研究与空白组比较,与模型组有34个蛋白上调、67个蛋白下调,四逆汤有效组分配伍治疗组可将上调蛋白中的14个蛋白下调2倍以上,将下调蛋白中的7个蛋白表达上调2倍以上。结论：1.四逆汤有效组分配伍对甲减具有较好的治疗作用,并可减轻由甲减所引发脑组织损害、肾脏损害、血脂代谢紊乱及心血管系统改变。2.四逆汤有效组分配伍可通过调控机体神经内分泌、自身免疫、甲状腺激素合成相关因子及相关基因等途径起到治疗甲减的作用。3.四逆汤有效组分配伍可影响甲减大鼠的血清蛋白质表达。