补中益气汤及其“益气升阳”配比组方的药效和代谢组学研究

研究背景和目的 脾虚证是中医的常见证候,脾虚患者常有消化吸收功能下降、营养不良、疲惫、消瘦等症状表现,现代研究表明,脾虚证与机体的消化、吸收和代谢有着密切的联系。 补中益气汤是金元时期的名医李东垣创制的经典方剂,常用于脾气虚脾不升清等证,是中医益气升阳法的代表方,其中以补中益气药物黄芪佐以柴胡、升麻的“益气升阳”配伍最为特色,方中黄芪为君,配伍轻清升散的柴胡、升麻,可协助益气中药助清阳上升之力。据古代文献记载,方中柴胡、升麻用量宜轻,而在文献记载和临床应用中,黄芪与柴胡、升麻的用量比例有不同情况,有待进行研究。 近年来科学技术的发展为中医药的研究提供了新的方法和手段,其中代谢组学方法具有综合分析、整体归纳、动态统筹等诸多特点,与中医学整体观念和辩证论治的思想具有共通之处,因此采用代谢组学方法将可更好地研究阐释中医药的理论内涵。 本论文研究将在课题组前期研究的基础之上,采用“五味偏食+控制饮食+游泳力竭”的方法建立脾虚证大鼠模型,进行补中益气汤及其配比组方对脾虚证大鼠药效作用及尿液代谢组学研究,考察补中益气汤原方及其配比组方对脾虚证大鼠的体重、脏器指数、血清中淀粉酶、胃黏膜H+-K+-ATP酶、小肠黏膜中钠依赖的葡萄糖转运体(SGLT1).葡萄糖转运体2(GLUT2).肽转运体1(PepTl).肝脏中的葡萄糖激酶(GK)、血清中乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)以及尿液中代谢物等的影响,比较补中益气汤与配比组方的药效差异,从药效学和代谢组学的角度验证补中益气汤原方中“益气升阳”药物配比的合理性,探讨补中益气汤中“益气升阳”配伍的意义。 研究方法 1、采用“五味偏食+控制饮食+游泳力竭”的复合因素造模方法建立脾虚证大鼠模型,观察并记录造模期间大鼠体重、饮食、大便、精神状态、行为变化等的改变情况,按照《脾气虚证动物模型症状量化积分表》进行症状表现计分,对比造模前后大鼠的体重和脾虚证宏观证候积分的变化情况,评价脾虚证大鼠模型是否复制成功。 2、采用“五味偏食+控制饮食+游泳力竭”的复合因素造模方法建立脾虚证大鼠模型,并给予补中益气汤原方、补中益气汤去柴胡、升麻组方(以下简称为去“柴-升”组方)和补中益气汤倍柴胡、升麻组方(以下简称为倍“柴-升”组方),考察比较补中益气汤原方及其配比组方给药治疗对脾虚证大鼠体重变化和脏器指数的影响。 3、在上述脾虚大鼠模型和给药实验的基础上,于实验结束后通过腹主动脉取血制备血清,摘取全胃制备胃黏膜匀浆,采用淀粉酶试剂盒测定各组大鼠血清中淀粉酶活性,采用H+-K+-ATP酶测定试剂盒(无机磷法)测定胃黏膜中H+-K+-ATP酶的活性,考察比较补中益气汤原方及其配比组方给药治疗对脾虚证大鼠血清淀粉酶活性和胃黏膜H+-K+-ATP酶活性的影响。 4、制备大鼠小肠黏膜匀浆,采用Westernblot法检测小肠黏膜中葡萄糖转运相关载体钠依赖的葡萄糖转运体1(SGLT1)和葡萄糖转运体2(GLUT2)以及肽转运载体1(PepT1)的蛋白表达水平,考察比较补中益气汤原方及其配比组方给药治疗对脾虚证大鼠小肠黏膜中葡萄糖转运相关载体和肽转运体蛋白表达水平的影响。 5、制备大鼠肝脏匀浆,采用Elisa试剂盒测定大鼠肝脏中葡萄糖激酶(GK)的活性；取血清,分别采用Elisa法和微量酶标法检测大鼠血清中琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的活性,考察比较补中益气汤原方及其配比组方给药治疗对脾虚证大鼠体内与物质和能量代谢相关酶活性的影响。 6、制备大鼠尿液检测样品,采用1H-NMR法分析各组大鼠尿液代谢物谱,依据化学位移值、峰的裂分情况、耦合常数及参考文献对代谢物谱峰进行归属,运用软件对数据进行主成分(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),筛选与脾虚证及补中益气汤作用相关的代谢标志物,考察比较补中益气汤原方及其配比组方治疗后对脾虚大鼠尿液中代谢物的影响。 研究结果 1、模型建立：采用“五味偏食+控制饮食+游泳力竭”复合因素造模方法建立的脾虚证大鼠在造模后体重较正常对照组明显减轻(P<0.05)；模型组大鼠在造模后的宏观证候积分显著高于正常对照组(P<0.05),且总积分>4分,提示脾虚证模型复制成功。 2、体重和脏器指数：脾虚证大鼠体重增长缓慢,补中益气汤原方及去“柴-升”组方给药后(二者无明显差异),均能使脾虚证大鼠体重明显增长(P<0.05)并接近于正常大鼠体重水平,而倍“柴-升”组方效果不显著。脾虚大鼠脾脏指数和胸腺指数均较正常对照组显著下降(P<0.05),补中益气汤原方、去“柴-升”组方和倍“柴-升”组方给药后,均可有效提高脾虚证大鼠的脾脏指数(P<0.05),使之接近于正常对照组；补中益气汤原方和去“柴-升”组方可有效提高脾虚大鼠的胸腺指数,而倍“柴-升”组方则效果不显著(P>0.05)。 3、血清淀粉酶和H+-K+-ATP酶活性：脾虚证大鼠血清淀粉酶活性显著降低(P<0.05),给予补中益气汤原方和去“柴-升”组方、倍“柴-升”组方后,均可有效提高血清淀粉酶的活性(P<0.05),其中以补中益气汤原方作用效果最为明显,补中益气汤组血清淀粉酶活性显著高于各配比组方组(P<0.05)。脾虚证大鼠H+-K+-ATP酶活性较正常对照组大鼠明显升高(P<0.05),而补中益气汤原方组和倍“柴-升”组方、去“柴-升”组方给药后脾虚证大鼠的胃黏膜H+-K+-ATP酶活性均较模型组显著降低(P<0.05),接近正常水平。 4、葡萄糖和肽转运体蛋白表达水平：脾虚证大鼠小肠黏膜中葡萄糖转运体(SGLT1、GLUT2)的蛋白表达水平均比正常对照组显著降低(P<0.05),肽转运体(PepT1)表达水平也较正常水平降低(P<0.05),补中益气汤原方给药后SGLT1、GLUT2的蛋白表达水平均比模型组显著提高(P<0.05)。去“柴-升”组和倍“柴-升”组给药后脾虚证大鼠GLUT2蛋白水平比模型组显著升高(P<0.05),SGLT1蛋白水平虽比模型组升高,但不具统计学意义(P>0.05)；各组药物治疗后,均有升高PepT1蛋白表达水平的作用趋势,但与模型组相比升高不显著(P>0.05)。 5、血清中LDH和肝脏中GK活性：各实验组的琥珀酸脱氢酶(SDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)活性均无明显差异。脾虚证大鼠血清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性较正常组显著下降(P<0.05)。补中益气汤原方给药后可升高脾虚大鼠血清中的LDH活性(P<0.05),而去“柴-升”组方和倍“柴-升”组方均未显著升高脾虚大鼠血清中的LDH活性。脾虚证大鼠肝组织中葡萄糖激酶(GK)的活性较正常组显著升高(P<0.05),补中益气汤原方治疗后可显著逆转葡萄糖激酶(GK)活性的升高(P<0.05),使其恢复至正常组的水平,而去“柴-升”组方和倍“柴-升”组方则未表现出明显的调节作用。 6、尿液代谢组学分析：通过代谢组学方法我们筛选得到8种与脾虚证相关的代谢产物,脾虚大鼠各代谢物的相对峰面积均较正常对照组显著减小(P<0.05)。补中益气汤具有提高其中6种代谢物水平的作用趋势。去“柴-升”组对8种代谢物均具有升高的作用趋势,其中对二甲基甘氨酸的升高作用具有统计学意义(P<0.05)；倍“柴-升”组仅对其中3种代谢有升高的作用趋势。 结论 脾虚证大鼠出现体重和脏器指数下降,消化相关酶活性改变,吸收转运相关载体蛋白表达水平降低和代谢酶活性改变等表现,提示脾虚证大鼠消化、吸收和代谢功能紊乱,此外脾虚证大鼠尿液中多种代谢物的异常也提示脾虚证大鼠体内物质和能量代谢异常,给予补中益气汤治疗可改善脾虚证大鼠的相关药效学指标及尿液中的代谢物,表明补中益气汤具有调节脾虚证大鼠消化吸收代谢功能异常的作用。其中补中益气汤原方对脾虚证大鼠药效学指标和尿液中代谢物的作用效果优于补中益气汤的配比组方(去“柴胡-升麻”和倍“柴胡-升麻”),说明补中益气汤原方中益气升阳药物的剂量配比较去“柴胡-升麻”和倍“柴胡-升麻”更为合理,实验结果证明了补中益气汤原方中益气升阳药物剂量配比的合理性,从科学数据支持了传统理论所认为的柴胡、升麻用量宜轻的观点。