药食同源夏枯草多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究

夏枯草是一种药食同源的多年生草本植物(唇形科夏枯草属),广泛分布于中国、韩国、日本和欧洲地区。在中国作为保健食品和传统中药被广泛用于治疗黄疸、肝病、淋病、肺结核和糖尿病等疾病;而在华南地区,人们又常将夏枯草用于煲汤或熬制凉茶。化学植物素研究表明夏枯草含有多种活性成分,其中多糖是其最主要的活性成分之一。本论文系统地研究了夏枯草多糖的提取、分离纯化、理化性质及构效关系,并研究了夏枯草多糖锌螯合物的制备、抗增殖活性及其作用机理,为夏枯草多糖源保健品或临床药物的开发提供理论依据。主要研究结果如下:(1)夏枯草的基本组成为:水分22.4%、灰分12.13%、总蛋白10.63%、总脂肪4.53%、粗纤维24.75%和总糖9.81%。采用响应面分析方法来优化超声提取夏枯草多糖,以多糖提取率为响应值,得出最优提取工艺条件为:料液比1:25,超声功率210 W,提取时间50 min;提取温度70°C,在此最优提取条件下,多糖的最大提取率为2.11%。此多糖中总多糖、蛋白质、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸及总多酚含量分别为87.5%、11.4%、6.26%、0.37%和1.95%;分子量分布为4720 kDa(56.1%)、31.8 kDa(3.02%)、4.87 kDa(11.6%)和0.69 kDa(29.2%);单糖组成包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔百分比含量分别为2.8%、28.2%、38.5%、11.0%、3.0%和16.5%。活性研究表明夏枯草多糖具有良好的清除DPPH和ABTS自由基能力和铁还原能力,还能够显著地抑制人肝癌细胞HepG2、胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7的增殖,而对正常肝细胞L02毒性较弱。(2)采用热水浸提法提取夏枯草多糖(PV-P),经离子交换柱层析分离得到一种中性多糖PV-P1(水洗脱组分),两种酸性多糖PV-P2(0.1 M NaCl洗脱组分)和PV-P3(0.2 M NaCl洗脱组分),其中PV-P1含量最高,占40.6%,PV-P2和PV-P3分别占5.34%和20.1%。化学组成和结构分析表明它们具有不同的化学组成、单糖组成和糖苷键类型,PV-P1具有较高的分子量大小和分支度,而PV-P2和PV-P3相似;此外,三组分均不具有三螺旋构象。活性研究表明三多糖组分均具有显著的抗氧化和免疫活性,其中PV-P2和PV-P3的抗氧化较强,能够显著地清除DPPH自由基、ABTS自由基和HOO自由基;而PV-P1的免疫活性最强,能够显著地刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌细胞免疫因子,如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6),且对RAW264.7细胞基本无毒性。(3)多糖组分PV-P1经葡聚糖凝胶柱层析纯化得到一种夏枯草杂多糖,命名为P1。研究结果表明P1为分子量较均一的杂多糖,呈类球型构象,其均值分子量大小为1750kDa,由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔百分比含量分别为28.37%、54.67%、5.61%、5.46%和5.89%;高碘酸氧化-Smith降解和核磁共振(NMR)结果表明P1主要由(1→5)-linkedα-L-Ara、(1→)-linkedα-L-Ara、(1→3)-linkedα-D-xyl、(1→3)-linkedβ-D-Gal、(1→3,6)-linkedβ-D-Gal、(1→3,6)-linkedα-D-Man和(1→6)-linkedα-D-Glc等糖苷键连接而成。免疫机理结果表明P1能够通过RAW264.7细胞膜上TLR2、TLR4和CR3受体的识别来激活免疫应答。此外,P1在pH 4.0-10.0和低于121°C条件范围下处理,能够保持较高的免疫稳定性。(4)采用夏枯草多糖P1与醋酸锌反应制得了夏枯草多糖锌螯合物(P1-Zn),锌元素含量达到27 mg/g,螯合方式以C-O-Zn配位为主。P1-Zn能够显著地抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,且呈剂量依赖效应,当浓度为500μg/mL时,细胞增殖抑制率达98.4%;形态学观察结果表明P1-Zn能够导致细胞生长密度降低,贴壁性减弱,细胞间隙变大,细胞粘附性变差,细胞核缩小,染色质凝缩,出现凋亡体;抗增殖机理研究结果表明P1-Zn可以通过使HepG2细胞的周期阻滞在G0/G1期和线粒体途径诱导的凋亡两方面来抑制HepG2细胞的增殖。(5)体内动物实验研究结果表明夏枯草多糖能够提高大鼠血清中抗氧化酶活性,包括超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),尤其当高剂量300mg·kg-1·d-1时;此外,夏枯草多糖能够有效地提高大鼠的胸腺指数、脾脏指数及血清中免疫细胞因子IFN-γ和IL-6的含量;这些结果表明了夏枯草多糖具有体内抗氧化和免疫调节活性。