疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD大鼠胃黏膜及平滑肌功能的影响

目的 研究中药疏肝健脾方对肝郁脾虚型FD模型大鼠一般情况、胃排空率、血浆中VIP和SP含量,胃体黏膜中VIP2R、SP2R、MLCK的表达,以及胃体平滑肌细胞中IP3、 cAMP、Ca2+含量等指标的影响；基于胃黏膜分泌功能和平滑肌运动功能探讨FD发病机制,以及该方治疗FD的疗效机制。 方法 1.造模及治疗采用SPF级SD健康大鼠64只,雌性,体重200-220g。适应性喂养一周后开始造模。随机分为正常对照组,模型对照组,中药组,西药组,每组16只。模型组给予慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的方法进行造模,造模时间共14天；造模后中药组给予对应体积疏肝健脾方药液(1g/m1),按8.54g/kg·d浓度给药(与人体体重等效剂量),西药组给予对应体积的多潘立酮溶液(0.35mg/ml),按2.7mg/kg·d浓度给药(与人体体重等效剂量)。模型对照组给予等量生理盐水,正常对照组给予等量蒸馏水灌胃,连续14天。 2.检测观察大鼠造模前、后及治疗后的一般状况；采用胃排空实验,进行胃动力评测；采用放射免疫法检测大鼠血浆中VIP、SP的含量；采用免疫组织化学染色法检测大鼠胃体黏膜层VIP2R、SP2R、MLCK的表达,以及大鼠胃体肌层MLCK的表达；分离大鼠胃体肌层平滑肌细胞,制成平滑肌细胞悬液,采用Elisa法检测平滑肌细胞中IP3、cAMP含量,流式细胞仪检测Ca2+的含量。 结果 1.实验期间大鼠体重变化 ①造模前,四组之间体重差异无统计学意义(P=0.092)；②造模两周后,与正常对照组相比,模型对照组、中药组、西药组大鼠体重增加缓慢,差异均有统计学意义(P<0.001)；③治疗后,与模型对照组相比,中药组、西药组大鼠体重增长变快,差异有统计学意义(P<0.001)；而中药组、西药组之间差异无统计学意义(P=0.07)。 2.胃排空率测定 四组大鼠胃排空率存在统计学差异(F=60.643,P<0.001)；与正常对照组比较,模型对照组大鼠胃排空率降低,差异有统计学意义(P<0.001)；与模型对照组比较,中药组、西药组大鼠胃排空率升高,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001)；中药组、西药组之间差异无统计学意义。 3.血浆中VIP、SP含量测定 四组大鼠血浆VIP、SP含量存在统计学差异(VIP:F=4.650, P=0.008; SP:F=3.304, P=0.031);与正常对照比较,模型对照组大鼠血浆中VIP含量升高、SP含量降低,差异有统计学意义(VIP:P=0.019; SP:P=0.031);与模型对照组比较,中药组、西药组大鼠血浆中VIP含量降低、SP含量升高,差异有统计学意义(VIP:P=0.002,P=0.004; SP:P=0.008, P=0.015);中药组、西药组两组之间大鼠血浆中VIP、SP含量差异无统计学意义(VIP:P=0.844; SP:P=0.708);中药组、西药组大鼠血浆中VIP、SP含量与正常对照组比较,差异无统计学意义(VIP:P=0.392, P=0.509; SP:P=0.546, P=0.803) 4.胃体黏膜中VIP2R、SP2R、MLCK表达 4.1胃体黏膜层组织中VIP-2R表达 镜下观察胃体组织中VIP-2R阳性表达主要分布在黏膜层,黏膜组织中VIP-2R阳性表达呈棕黄色,以胞浆膜染色为主,着色深。阳性细胞主要分布在黏膜固有层腺体细胞中。 四组之间表达强度存在差异(F=5.756,P=0.003),与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义(P=0.001),与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义(P=0.018,P=0.003),中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异(P=0.3465)。 4.2胃体黏膜层组织中SP-2R表达 镜下观察胃体组织中SP-2R阳性表达主要分布在黏膜层,黏膜组织中SP-2R阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色较浅。阳性细胞主要分布在黏膜固有层腺体细胞中。 四组之间存在差异(F=3.294,P=0.035),与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义(P=0.008),与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义(P=0.032,P=0.022),中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异(P=0.872)。 4.3胃体黏膜中MLCK表达 MLCK免疫阳性细胞分布极广,在黏膜下肌层、肌层平滑肌细胞中普遍均匀分布,平滑肌纤维呈浅棕色染色,核呈淡蓝色；胃体黏膜固有层腺体也有较强表达,腺体细胞中MLCK阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色深。 四组之间存在差异(F=5.396,P=0.005),与正常组相比,模型组平均光密度降低,两者差异有统计学意义(P=0.001),与模型组比较,中药组、西药组平均光密度升高,差异有统计学意义(P=0.005,P=0.021),中药组、西药组之间平均光密度无统计学差异(P=0.546)。 4.4胃体肌层组织MLCK表达 镜下观察胃体肌层细胞中MLCK阳性表达呈棕黄色,以胞浆染色为主,着色深。平滑肌细胞普遍染色,胞浆内着色均匀分布。 四组之间不存在统计学差异差异(F=0.711,P=0.554)。 5.胃体平滑肌细胞中IP3、cAMP、Ca2+含量的测定 5.1平滑肌细胞内IP3的浓度测定 四组之间IP3的浓度存在差异(F--5.027,P=0.007)；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中IP3的浓度降低,差异有统计学意义(P=0.008)；与模型组比较,中药组、西药组IP3的浓度升高,差异有统计学意义(P=0.002,P=0.003)；中药组、西药组之间差异无统计学意义。 5.2平滑肌细胞内cAMP的浓度测定 四组之间cAMP的浓度存在差异(F=4.901,P=0.007)；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中cAMP的浓度降低,差异有统计学意义(P=0.016)；与模型组比较,中药组、西药组cAMP的浓度升高,差异有统计学意义(P=0.005,P=0.002)；中药组、西药组之间差异无统计学意义(P=0.652) 5.3平滑肌细胞内游离Ca2+含量测定 四组之间的Ca2+浓度存在差异(F--9.413,P<0.001)；与正常组比较模型组大鼠胃体平滑肌细胞中Ca2+的浓度升高,差异有统计学意义(P<0.001)；与模型组比较,中药组、西药组Ca2+的浓度降低,差异有统计学意义(P=0.003,P<0.001)；中药组、西药组之间差异无统计学意义(P=0.159)。 结论 1.肝郁脾虚型FD模型大鼠存在,外周血中胃肠激素水平的异常,黏膜层腺体中VIP2R、SP2R、MLCK表达强度的下降,以及静息状态下胃体平滑肌细胞胞内Ca2+浓度异常增高、IP3、cAMP等第二信使水平下降等异常情况。因此,在胃肠神经内分泌系统紊乱基础上,大鼠胃黏膜分泌功能异常和平滑肌运动功能障碍可能是FD发病机制之一。 2.中药疏肝健脾方可对肝郁脾虚型FD模型大鼠产生有效的治疗作用,可改善其精神饮食等一般状态,并促使其胃排空功能的改善,其治疗机制可能与改善大鼠胃黏膜分泌功能和平滑肌运动功能有关。