肺癌与炎症性胸腔积液蛋白质荧光差异双向电泳图谱分析

肺癌近年来已经成为发病率和死亡率最高的肿瘤之一。肺癌的临床预后很差,由于缺乏敏感而准确的筛查方法,其五年生存率仅为15%。所以通过患者的体液如血液、胸腔积液等寻找高特异性、高敏感性的肿瘤标志物具有重大意义。与血液中蛋白质来源纷杂不同,胸腔积液通常是由肺部病变直接产生,其中可能包含肿瘤特异的分泌蛋白,因而是筛选高敏感性和特异性的肺部肿瘤相关标志物的合适载体。分析胸腔积液中分泌蛋白的组成还有助于进一步探讨肺部疾病发生发展的分子机理。目前,以蛋白质组学技术为代表的高通量筛查手段的兴起为寻找肿瘤标志物提供了新的契机。利用凝胶分离结合质谱的蛋白质组学技术研究肺癌的渗出性胸腔积液的蛋白质组成,首先需要去除其中的高丰度蛋白,从而减少其对低丰度蛋白的遮蔽效应,提高分离技术的敏感性。同时,有必要采用非肿瘤性肺部炎症性疾病的胸腔积液作为对照研究,用以消除常规炎症免疫反应对于筛选肿瘤特异性分泌蛋白的影响。所以,本研究在建立胸腔积液高丰度蛋白去除的蛋白质组学技术基础上,选取肺(腺)癌患者胸腔积液为主要研究对象,以肺炎和结核的胸腔积液标本作为对照,结合荧光差异双向凝胶电泳分离技术(2D-DIGE),分析肺腺癌与肺部良性炎症病变胸腔积液之间蛋白表达谱的差异,为进一步质谱鉴定潜在肿瘤特异相关的差异蛋白质的结构和功能建立研究平台。 研究方法和主要结果: 首先对3例肺(腺)癌患者及2例结核患者的胸腔积液进行了初步分析,采用传统的双向凝胶电泳分离和银染方法来检验样品制备的质量,并比较了高丰度蛋白去除(白蛋白去除试剂盒,Sigma公司)的效果。结果显示,去除高丰度白蛋白后增加了778个蛋白点,检出率提高80%,成功建立了胸腔积液高丰度蛋白去除的蛋白质组学技术平台。在对5例胸腔积液进行初步差异分析后,进一步对部分差异蛋白进行了MALDI-TOF-MS质谱鉴定,其中一个蛋白点被鉴定为14-3-3蛋白家族的成员“14-3-3ζ”,且结果被Western blot证明。这是首次发现该蛋白可以作为分泌蛋白出现在胸腔积液中。 在此基础上,我们进而选取10名肺(腺)癌患者,6名结核性胸膜炎患者及4名肺炎患者的胸腔积液标本,采用了准确性更高的荧光差异双向凝胶电泳技术(2D-DIGE)对3类疾病的差异蛋白图谱进行分析。结果发现:肺腺癌组和结核组比共找到10个差异点;肺腺癌组和肺炎组比共找到34个差异点;结核组和肺炎组比共找到16个差异点。3类疾病间共找到差异点为41个。其中,肺腺癌组和肺良性炎症疾病组(结核与肺炎)胸腔积液之间共找到6个存在的差异表达蛋白点,其中4个在肺腺癌组中表达水平均上调,2个在肺腺癌胸腔积液中表达水平均下调,且改变幅度比较接近。 主要结论: 1)建立去除胸腔积液中主要高丰度蛋白(白蛋白)的分析平台后,比传统的双向凝胶电泳分离和银染方法可多检测80%的蛋白点。说明去除高丰度蛋白可有效提高低丰度蛋白的检出率。 2)首次发现14-3-3蛋白家族成员“14-3-3ζ”可出现在胸腔积液中,其结果被Western blot证明。进一步说明,去除高丰度蛋白对于胸腔积液差异蛋白质组学研究非常重要,它可以发现一些传统手段无法检出的低丰度蛋白。 3)通过对肺(腺)癌患者和肺部良性炎症疾病患者(肺炎、结核)的胸腔积液标本进行蛋白质荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)图谱分析,在3类疾病间共找到41个差异蛋白点。在肺腺癌组和肺良性炎症疾病组胸腔积液之间找到6个差异表达蛋白点,其改变方向完全一致,且改变幅度比较接近,说明这些共有的差异蛋白点很可能与肺腺癌的发生、发展密切相关。