目的:肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤复发转移和异质性的主要原因。根据肿瘤干细胞的生物学特性及其相关信号通路,发现调控干细胞治疗靶点,靶向清除肿瘤干细胞,成为目前抗肿瘤新策略的研究热点。Hippo-YAP蛋白是维持干细胞干性,沟通Hippo信号通路与其他干细胞调节通路如Wnt、hedgehod、Notch的核心分子,它的缺失或者其下游效应蛋白YAP/TAZ的活性抑制可导致干细胞失去干性。祛瘀解毒汤是广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心肠癌治疗经验用方(已申请专利),具有较好的临床疗效,对结直肠瘤细胞增殖较强的抑制作用。已有前期研究证实正常结直肠组织的细胞核、细胞质中YAP都呈阴性表达,而癌组织中YAP可在细胞核及细胞质中都呈阳性表达,而且YAP与结直肠癌干细胞标志物CD133表达一致。且前期临床研究证实YAP与结直肠癌术后复发转移有一定相关性。另外前期基础研究已通过体外干细胞分离培养,获得并鉴定了具有干细胞特性的结肠癌干细胞。我们推测祛瘀解毒汤可以通过调控Hippo信号通路中核心蛋白YAP的表达而干预结肠癌转移的。本研究拟通过体外实验观察祛瘀解毒汤对结肠癌HCT116干细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响,检测Hippo信号通路中YAP蛋白的表达,以探究祛瘀解毒汤是否通过调控Hippo信号通路中YAP蛋白来干预结肠癌干细胞转移的机制,为揭示中药复方抗癌转移机制的研究提供理论支持和实验依据。方法:人结肠癌HCT116原代细胞使用无血清培养基,培养12-14天后,形成肉眼可见HCT116干细胞克隆球。运用CCK8法观察单纯祛瘀解毒汤、单纯化疗药物以及祛瘀解毒汤联合化疗药物对结肠癌HCT116干细胞细胞增殖能力的抑制作用。通过流式实验分析结肠癌干细胞干细胞标志物CD44,CD133的表达率。通过体外基质胶迁移和侵袭实验检测不同药物组对结肠癌HCT116干细胞迁移和侵袭能力的影响。运用免疫荧光、western-mot方法探讨祛瘀解毒汤对结肠癌HCT116干细胞中YAP蛋白的表达。结果:CCK-8实验中,同空白对照组相比,不同实验组(75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组、2 mg/ml 5-fu组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组)干预肠癌HCT116干细胞24h、48h、72h后,发现各实验组对肠癌干细胞HCT116细胞的增殖能力的抑制作用均具有浓度依赖性,即作用相同时间的情况下,随着药物浓度的增加,细胞存活率逐渐降低,差异具有统计学意义,(p<0.01),同时还观察到随着药物作用时间的延长,其生长活力虽在也逐渐下降但是无明显时间依赖性,也就是说,不同作用时间段相同浓度实验组对细胞活力的影响差异无统计学意义,P>0.05。(2)与阳性实验对照组(2mg/ml 5-fu组)相比,(75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组)干预肠癌HCT116干细胞24h、48h、72h后,发现不同时间段下单纯中药组(75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组)以及中药联合化疗药物组(75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml5-fu组)对肠癌干细胞HCT116细胞的增殖能力的抑制作用均强于单纯化疗药物组(2mg/ml 5-fu组),其差异具有统计学意义,(p<0.01)。(3)单纯中药组(75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组)以及中药联合化疗药物组(75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组)干预肠癌HCT116干细胞24h、48h、72h后,其结果显示,发现24h、48h、72h不同时间段75mg/ml祛瘀解毒汤组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml 5-fu组对细胞活力的影响差异有统计学意义,P<0.01,125mg/ml祛瘀解毒汤组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组对细胞活力的影响差异无统计学意义,P>0.01。流式分析仪检测不同实验组对结肠癌HCT116干细胞标志物CD133+、CD44+表达的影响的实验中,经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu处理后的肠癌HCT116干细胞标志物与空白对照组相比均明显减少。同阳性对照组(2 mg/ml 5-fu)相比,单纯中药组及中药联合化疗药物组干细胞标志物均减少,差异有统计学意义,P<0.01。单纯中药组与中药联合化疗药物组相比较,75浓度组和75+fu浓度组对干细胞标志物的影响差异有统计学意义,P<0.01。125浓度组和75+fu浓度组对干细胞标志物的影响差异无统计学意义,P>0.01。体外Transwell迁移实验中,经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu处理后的肠癌HCT干细胞和在高倍镜下迁移至下室的细胞数与空白对照组相比均明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01)。75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组同2mg/ml 5-fu组相比,75mg/ml祛瘀解毒汤组同2mg/ml 5-fu组相比,差异无统计学意义,P>0.01,125mg/ml祛瘀解毒汤组同2mg/ml 5-fu组相比,差异无统计学意义,p>0.01,75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组同2mg/ml 5-fu组相比,差异有统计学意义,p<0.01。体外Transwell侵袭实验中,经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu处理后的肠癌HCT干细胞和在高倍镜下穿过下室的细胞数与空白对照组相比均明显减少。75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组(和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组同2mg/ml 5-fu组相比,75mg/ml祛瘀解毒汤组同2mg/ml 5-fu组相比,差异无统计学意义,P>0.01,125mg/ml祛瘀解毒汤组同2mg/ml 5-fu组相比,差异无统计学意义,p>0.01,75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组同2mg/ml 5-fu组相比,差异有统计学意义,p<0.01。流式分析仪检测不同实验组对标志蛋白E-cadherin表达的影响实验中,经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu处理后的EMT标志蛋白E-cadherin标记物与空白对照组相比均明显减少。同阳性对照组(2 mg/ml 5-fu)相比,单纯中药组及中药联合化疗药物组EMT标志蛋白E-cadherin标记物均减少,差异有统计学意义,P<0.01。单纯中药组与中药联合化疗药物组相比较,75浓度组和75+fu浓度组对EMT标志蛋白E-cadherin标记物影响差异有统计学意义,P<0.01。125浓度组和75+fu浓度组对EMT标志蛋白E-cadherin标记物影响差异无统计学意义,P>0.01。免疫荧光结果发现,空白对照组中结肠癌干细胞HCT116中YAP蛋白在细胞浆、细胞膜和细胞核上均呈现明亮的绿色荧光,呈现强表达,而经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml 5-fu处理结肠癌HCT116干细胞后,同空白对照组相比较,75mg/ml祛瘀解毒汤组、125mg/ml祛瘀解毒汤组、2 mg/ml 5-fu组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2 mg/ml 5-fu组低浓度组的胞浆、胞膜和胞核均呈现较空白对照组弱的绿色荧光,其中125mg/ml祛瘀解毒汤组75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml 5-fu组的免疫荧光较空白对照组明显减弱。这说明,YAP在结肠癌HCT116干细胞表达定位于细胞膜、细胞浆和细胞核,经过中不同组药物处理后无论是胞膜、胞浆还是胞核均出现一定程度的减弱。Western-Blot结果发现经75mg/ml祛瘀解毒汤、125mg/ml祛瘀解毒汤、2mg/ml5-fu和75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml 5-fu处理后的结肠癌HCT116干细胞,同空白对照组相比较,与HIPPO信号通路密切相关的YAP蛋白的表达水平明显降低。同阳性对照组2mg/ml 5-fu相比,125mg/ml祛瘀解毒汤组和75mg/ml祛瘀解毒汤+2mg/ml 5-fu组中YAP蛋白的表达明显较少。结论:1.在体外实验研究中,我们发现祛瘀解毒汤可显著抑制结肠癌HCT116干细胞的生长和增殖能力,具有一定的浓度依赖性,还发现祛瘀解毒汤可显著抑制结肠癌干细胞的迁移和侵袭能力。2.祛瘀解毒汤可能通过抑制hippo信号通路中核心蛋白YAP的表达来降低结肠癌干细胞的增殖、迁移和侵袭能力从而干预结肠癌的转移。3.我们还发现祛瘀解毒汤联合化疗药物可以达到更好的抑制结肠癌干细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
