葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究

研究背景:“酒精滥用”和“酒精依赖”是造成酒精性肝病高发病率和死亡率的主要危险因素,已成为仅次于病毒性肝病的第二大肝病,严重危害人类健康。酒精性肝脏疾病是由急性或慢性饮酒引起的肝脏代谢疾病,早期以单纯性脂肪肝病变为主,继而向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等不可逆病变发展。尽管酒精性肝脏疾病对全球的经济和健康产生了深远的影响,但目前对于该病治疗药物的研究进展甚微,除戒酒和营养支持外,尚无令人满意的治疗策略。酒精性肝病当属中医“酒疸”、“酒痨”、“酒癖”、“酒臌”、“伤酒”、“酒中毒”等范畴。急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于酒食不节,酒毒湿热之邪蕴阻中焦,继而伤及脾胃,致运化失司,水湿失运,变生痰浊,而后湿热搏结,阻滞中焦或土雍木郁,致肝脾同病。其病位在肝,涉及胆、脾、胃,酒毒湿热之邪蕴结体内是根本病机。葛花和枳椇子为我国传统解酒中药,古代医药文献有对两药同用解酒毒的记载。葛花发散宣透,引湿热从肌表而散枳椇子渗泄利尿,使湿热之邪从小便而下,二者配伍,散渗结合,分消湿浊,因势利导,使酒湿邪气排出体外,起到解酒保肝的作用。课题组前期已经完成单味中药葛花、枳椇子对急性酒精中毒性治疗,并进行了葛花枳椇子不同比例配伍对慢性酒精性肝损伤的实验研究,研究明确了二者配伍对酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,可以不同程度地改善相关指标,起到解酒护肝的作用。研究目的:酒精性肝损伤是全球亟待解决的公共卫生问题之一,是疾病晚期难以治愈的进行性疾病,若早期阶段能及时防治,可阻止其向不可逆病变发展,故防治急性酒精性肝损伤尤为迫切,但目前相关研究较薄弱。乙醛介导的毒性,氧化应激和脂质代谢失衡通常认为与酒精性肝病的发病密切相关。转录因子Nrf2是防治氧化应激介导疾病的关键治疗靶标,Keap1-Nrf2-ARE信号通路是调控细胞保护酶的关键调节剂,在酒精性肝损伤的早期发挥着重要作用。故本课题在前期研究的基础上,以葛花和枳椇子配伍为研究对象,开展二者配伍对酒精引起的急性肝脏损伤保护作用的实验研究。采用白酒灌胃复制动物模型,动态观察肝损伤情况,通过生物化学、组织病理学、分子生物学等技术方法,探讨二者配伍能否激活Keap1-Nrf2-ARE通路诱导抗氧化酶活性而保肝。中医理论认为急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于湿热毒邪蕴结体内,损伤及脾,致脾之运化功能失司,累及肝胆,诱发“伤酒”。越来越多的证据显示,水通道蛋白AQPs的正常表达可能是运化水湿,津液输布,维持体内水代谢稳态的分子生物学基础,而AQP表达异常可能是湿热证病理机制之一。酒精诱导的氧化应激在急性酒精性肝病的早期阶段发挥着重要作用,是引发脂质代谢异常,促进脂质过氧化,造成肝脏脂质蓄积的关键因素。水甘油通道蛋白AQP9是参与甘油和甘油三酯代谢的重要通道蛋白,在调控脂质代谢,维持甘油代谢平衡方面发挥着重要作用。故本研究同时尝试结合中医发病机制,探讨二者配伍能否影响水-甘油通道蛋白AQP9表达而调节肝中脂质代谢,从而研究药物对急性酒精性肝损伤的保护作用,为临床用药提供科学依据,并为开展其他酒精性相关疾病的研究提供思路和借鉴。研究方法:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇代谢的影响:小鼠按体重随机分成模型组、阳性对照药(水飞蓟宾)组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ(1:1)组、葛花枳椇子配伍Ⅱ(1:2)组、葛花枳椇子配伍Ⅲ(2:1)组,共计7组,每组15只。采用56%(V/V)红星二锅头白酒,一次大量灌胃(模型Ⅰ组)和连续多次灌胃(模型Ⅱ组)两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据酒精在体内的代谢特点,分别于酒后不同时间点(1h、4h和10d)取材,运用顶空气相色谱法和紫外-可见分光光度法检测血液中乙醇浓度和肝中乙醇脱氢酶活性。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能、血脂水平和肝组织病理形态的影响:小鼠按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照药(水飞蓟宾)组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ(1:1)组、葛花枳椇子配伍Ⅱ(1:2)组、葛花枳椇子配伍Ⅲ(2:1)组,共计8组,每组15只。采用56%(V/V)红星二锅头白酒,一次大量灌胃(模型Ⅰ组)和连续多次灌胃(模型Ⅱ组)两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据血清酶学改变特点,分别于酒后不同时间点(4h、6h、12h、16h和10d)取材,检测肝功能(ALT、AST、ALP、ALB和TP含量)、血脂水平(TG和CHO含量)及肝组织形态变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织氧化应激的影响:运用紫外分光光度法检测酒后不同时间点(4 h、6 h、12 h、16 h和10 d)小鼠肝脏组织中SOD、MDA和GSH的吸光度,荧光分光光度法测定肝组织中ROS的吸光度,并计算其在组织中的活力。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用机制的探讨:运用RT-PCR和Western blot方法,分析检测酒后不同时间点(12 h和10 d)小鼠肝脏组织中Keap 1、Nrf2和AQP9 mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血液乙醇浓度与肝中乙醇脱氢酶的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠(酒后1h和4h):与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均显著降低血液中乙醇浓度,并升高肝脏乙醇脱氢酶活性,其中葛花-枳椇子(2:1)组在促进乙醇的代谢方面具有较好的治疗作用,显现出较好的解酒作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠(酒后10d):与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)血清中乙醇含量显著降低,肝组织中乙醇脱氢酶活性增强,即各给药组通过调控ADH脱氢酶系统,促进乙醛的消除,并减轻乙醇诱导的肝脏损伤,显现出一定的解酒作用。其中,葛花-枳椇子(2:1)组在加速酒精代谢方面,显现出较好的治疗作用,具有出较好的解酒作用。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能与肝组织病理形态学的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠(酒后4h、6h、12h和16h):与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT和ALP水平显著升高,TP和ALB含量显著降低,光镜下肝小叶和肝索结构紊乱,肝细胞水肿或空泡变性,并伴有炎性细胞浸润、脂肪滴的形成,即酒精造成肝脏组织及功能受损,提示模型复制成功。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均可显著降低小鼠血清中AST、ALT和ALP水平,升高小鼠血清TP和ALB含量,从而改善小鼠的肝脏功能。葛花-枳椇子(2:1)组在改善酒精(酒后12h)造成的肝脏血清转氨酶及肝脏蛋白质合成功能异常方面优于其它各给药组。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的微泡样脂肪变性、脂质滴积聚、肝细胞水肿和炎性损伤等病理改变,对酒精诱发的急性肝损伤具有保护作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠(酒后10 d):与空白组相比,模型组小鼠血清ALT、AST和ALP含量显著升高,TP和ALB水平明显降低,表明酒精引起小鼠肝脏功能异常,造成了急性肝脏损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均不同程度地改善肝脏功能和蛋白合成功能。葛花-枳椇子(2:1)组在改善肝脏功能及蛋白合成功能方面优于其它各给药组,即该配伍组对酒精诱导的肝损伤具有较好的肝保护作用。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的肝细胞肿胀、微泡样脂肪变性、炎性细胞浸润和脂质滴积累等病理变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血脂水平及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠(酒后4h、6h、12h和16h):与空白组相比,模型组小鼠血清TG和CHO水平显著升高,即酒精造成小鼠血脂功能的异常。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均显著改善血清脂质代谢紊乱。葛花-枳椇子(2:1)组在降低酒精(酒后12h)引起的血清TG和CHO水平升高方面优于其他各给药组。此外,葛花、枳椇子及其各配伍组(1:1、1:2和2:1)均能抑制AQP9的表达,减少肝细胞对甘油的摄入,改善脂质代谢,从而有效缓解肝脏脂肪变性,起到保护肝脏的作用。各给药组在调控AQP9表达,缓解酒精引起的脂质代谢异常方面,均无显著差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠(酒后10 d):模型组小鼠血清TG和CHO水平显著高于空白组,即急性酒精摄入造成小鼠脂质代谢紊乱。葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均显著降低血清TG和CHO的水平,并抑制AQP9的表达,对酒精造成的血脂异常具有一定的改善作用,起到保护肝脏的作用。葛花-枳椇子(2:1)组在改善急性酒精摄入造成的高脂血症方面优于其他各给药组,即该配伍组在减少肝脂质积累,缓解脂质代谢异常方面显现出较好的治疗作用。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏氧化与抗氧化平衡及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠(酒后4 h、6 h、12 h和16 h):与空白组相比,模型组小鼠肝脏SOD和GSH水平均明显降低,MDA和ROS活力均显著升高,即表明单次大剂量酒精灌胃会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均可增强抗氧化酶活性,促进肝细胞对脂质过氧化产物的清除,即各给药组均具有抗氧化应激作用,对酒精诱导的肝脏损伤具有潜在的保护作用。其中葛花-枳椇子(2:1)组在增强抗氧化活性,抑制脂质过氧化作用,缓解酒精(酒后12 h)介导的肝细胞氧化应激损伤方面显现出较好的治疗作用,即该配伍组可显着预防酒精引起的急性肝损伤。此外,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)可通过抑制Keap1表达,激活Nrf2表达,从而有效地抑制自由基的产生和脂质过氧化,缓解小鼠氧化应激反应,保护肝脏免受酒精诱导的肝细胞损伤。各给药组在调控Keap1-Nrf2-ARE信号传导通路,保护肝组织免受酒精诱导的氧化损伤方面,均无显著差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠(酒后10 d):与空白组相比,模型组小鼠在白酒连续灌胃10天后,肝脏SOD和GSH活性均明显降低,MDA和ROS含量均显著升高,即表明连续大量酒精摄入会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组(1:1、1:2和2:1)均通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强肝脏内抗氧化酶的表达(SOD和GSH),加快脂质过氧化物(MDA和ROS)分解代谢,减少酒精对小鼠肝组织的损害。此外,葛花-枳椇子(2:1)组在增强小鼠抗氧化能力,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤方面优于其他各给药组,即该配伍组对缓解酒精诱导的肝损伤表现出积极作用。研究结论:综上所述,本研究证实葛花、枳椇子及各配伍组(1:1,1:2和2:1)对酒精诱导的急性肝损伤具有保护作用。首先,各给药组通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤,从而缓解酒精对小鼠的肝脏损害,发挥保护肝脏的作用。其次,各给药组通过调控水-甘油通道蛋白AQP9的表达,降低甘油的渗透性,减少甘油的摄入,改善肝脏脂质代谢异常,从而缓解酒精诱导的氧化应激和肝脂肪变性,起到保护肝细胞的作用。值得注意的是,葛花-枳椇子(2:1)组在促进酒精代谢,改善肝脏功能,减轻肝脏脂肪变性,提高小鼠抗氧化能力方面显现出积极作用,即该配伍组对酒精诱导的肝脏损伤具有较好的保护作用。因此,本研究证实葛花枳椇子配伍对急性酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,并明确了二者配伍产生相须为用、协同增效的功用,具有增强解酒保肝的效果,是治疗酒精性肝病的天然解酒保肝药物,为临床应用葛花枳椇子防治急性酒精性肝损伤提供了科学依据。