人参稀有皂苷脂肪酸修饰及其生物活性研究

现代药理学研究证明人参稀有皂苷具有很强的抗肿瘤活性。人参中的常规皂苷如Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd进入人体后经过体内肠道细菌的代谢作用,发生逐级脱糖基作用,最终得到人参稀有皂苷。人参三醇组皂苷经过代谢后主要得到Rh1、F1以及20(S)-PPt；人参二醇组皂苷经过代谢后主要得到M1、Mc、F2以及20(S)-PPd,这些稀有皂苷由于极性低,易被人体吸收,通过血液循环进入肝脏完成脂肪酸酯化,最终得到人参稀有皂苷脂肪酸酯,药理学研究表明酯化后的产物毒副作用更小,代谢时间更长,抗肿瘤活性更强。自从1983年日本学者从红参中发现人参皂苷Rh2后,国内外学者都对该化合物进行了广泛的药理学研究,药代动力学研究发现Rh2的口服生物利用度明显好于Rg3,约为16%(Rg3为3%)。沈阳药科大学李柯研究发现Rg3经小鼠给药后主要分布在肝脏中并代谢转化为Rh2和苷元。对Rh2的药理研究发现它确实呈现出显著的抑制癌细胞的增殖和诱导凋亡的作用,甚至部分作用强于Rg3。本实验基于上述研究,在体内外进行了人参皂苷Rh2的脂肪酸酯结构修饰研究。 首先是人参皂苷二醇组和三醇组的分离,为降低分离成本,本实验采用NKA-12和AB-8树脂相结合,利用NKA-12价廉来分离人参茎叶总提取物获取人参茎叶总皂苷；使用大孔树脂AB-8分离人参茎叶总皂苷获取人参二醇组和人参三醇组皂苷,为后续修饰底物的制备提供强大的物质基础。 其次为获取稀有人参皂苷,本文从三个方面考察了人参皂苷的转化规律,分别是碱水解转化,酶转化,热加工。a)碱水解转化化：通过考察,实验发现使用碱水解可以制备稀有人参皂苷Rh1、Rh2、Rh3、S-PPd、S-PPt、F2、Rg5等化合物,本文着重考察了20(S)-Rh1、20(S)-Rh2、20(S)-PPd、20(S)-PPt四个化合物的最佳制备方法,并使用最佳制备方法分别制备人参皂苷20(S)-Rh1、20(S)-Rh2、20(S)-PPd、20(S)-PPt,转化率均在30%以上。b)酶解法转化：本文考察了蜗牛酶对人参茎叶皂苷的转化能力,结果显示,使用酶解法转化产物复杂,可以获取人参皂苷C-K、Mc、Mx、C-Y、C-O、F1、Rh1等稀有人参皂苷,这些稀有皂苷使用酸碱水解法以及热加工法都无法获取。c)热加工法(黑参的加工)：通过HPLC-MS研究黑参提取物,我们发现黑参中含有丰富的Rg3、Rg5、Rh4、Rk1、F4、Rk3,这些稀有皂苷都是热加工的产物。本实验优化了传统的九蒸九曝的方法,通过研究,实验发现仅需4-6次加工就可获取稀有皂苷含量最高的黑参,这极大缩短了黑参的生产周期和生产成本。 本文以人参皂苷Rh2为底物,以辛酰氯为酰化试剂,以三乙胺为催化试剂,合成得到两个化合物,经现代光谱(ESI-MS,1HNMR,13CNMR, HMBC, HMQC)鉴定为C-Rh2(辛酰基链接在母核C-12位)和D-Rh2(辛酰基分别链接在母核C-12位和糖基的C'-6位)。通过修饰发现,这些在C-20位未链接糖时,C-12空间位阻极大缩小,使得酰化反应优先发生在母核的C-12位。 本实验建立较完善的合成方法,通过HPLC含量测定C-Rh2转化率为：46.3%；D-Rh2转化率为：67.3%。 本实验采用了体内和体外相结合的方法对人参皂苷修饰产物C-Rh2和D-Rh2的抗肿瘤活性评价。通过MTT法测定了化合物C-Rh2、D-Rh2和Rh2体外抑制HepaG2肿瘤细胞,其IC50分别为：Rh2为7.40μM; C-Rh2为18.10μM；D-Rh2>40μM。修饰产物均不如人参皂苷Rh2,但三化合物都具有很强的抗肿瘤活性。通过体内对H22荷瘤小鼠抗肿瘤实验发现,抗肿瘤结果显示阳性药环磷酰胺(CTX)抑瘤率达到76.6%；人参皂苷Rh2的肿瘤抑制率达到71.1%,接近阳性药,C-Rh2和D-Rh2抑瘤率均达40%以上,其中C-Rh2高剂量组达到67.1%,抗肿瘤活性接近阳性药,然而阳性药对免疫指数中胸腺指数影响较大,而C-Rh2则对免疫指数影响较小。 本实验通过使用四氧嘧啶诱导制作糖尿病小鼠模型,观察人参皂苷Rh2、C-Rh2和D-Rh2对糖尿病小鼠的治疗作用。经过14天治疗,与模型组相比较人参皂苷C-Rh2低剂量组血糖降低了42.5%(P<0.05),人参皂苷D-Rh2高剂量组血糖降低了38.4%(P<0.05),人参皂苷D-Rh2低剂量组降低31%,人参皂苷C-Rh2高剂量组降低24.8%。然而人参皂苷Rh2高剂量组和低剂量组血糖都未降低,且两组各死亡3只。C-Rh2治疗组和D-Rh2治疗组小鼠的糖耐量与模型组相比明显改善,AUC都有所降低,其中C-Rh2高剂量组降低28.7%(P<0.05),C-Rh2低剂量组降低34.7%(P<0.01),D-Rh2高剂量组降低19.2%,D-Rh2低剂量组降低29.6%(P<0.05),而人参皂苷Rh2治疗组未见AUC降低。阳性药胰岛素降血糖效果非常明显,给药后30min内下降至2.36mmol/L,60min检测血糖发现血糖值低于2.2mmol/L,120min内都未见血糖升高。综上人参皂苷Rh2修饰产物具有开发为糖尿病辅助药品的潜力。 人参皂苷的抗肿瘤和辅助治疗糖尿病作用已经成为科学研究的热点,基于其广泛生理活性的特点已经为人们接受。本实验合成的低极性人参皂苷Rh2衍生物具有较强的抗肿瘤和抗糖尿病作用,体现了较高的药用价值和应用前景。