多烯紫杉醇对人食管癌细胞的放射增敏作用及其机制的实验研究

目的：通过观察多烯紫杉醇对人食管癌ECA109和TE-13细胞增殖、细胞周期分布、凋亡率及相关蛋白表达的影响，探讨多烯紫杉醇对人食管癌细胞放射增敏的作用机制，为临床应用提供理论依据。 方法： 1体外培养人食管癌ECA109和TE-13细胞，采用MTT法测定不同浓度（0、0.1、0.5、1、5、10、50、100nM）多烯紫杉醇作用细胞24h、48h、72h后的增殖情况，绘制细胞生长曲线，筛选出低细胞毒性药物浓度进行后续实验。 2采用克隆形成实验检测1nM和0.5nM的多烯紫杉醇对食管癌ECA109和TE-13细胞的放射增敏作用。 3将ECA109、TE-13两株细胞分别设为空白对照组、单纯照射组（4Gy照射）、单纯药物组（1nM和0.5nM多烯紫杉醇）、药物加照射组（1nM和0.5nM多烯紫杉醇加4Gy照射），采用流式细胞技术测定不同处理后24h、48h、72h各组细胞周期分布及凋亡率的情况。 4采用western blotting技术检测1nM多烯紫杉醇对食管癌ECA109细胞照射后24h，p21、bax、bcl-2蛋白表达的影响。 结果： 1MTT结果显示：不同浓度多烯紫杉醇（0、0.1、0.5、1、5、10、50、100nM）作用食管癌ECA109和TE-13细胞24h后，与对照组比较，各处理组OD值下降均不明显（P>0.05）；作用细胞48h、72h后，各处理组细胞OD值较对照组均显著下降，差异具有统计学意义（P <0.05），各处理组间比较差异同样具有统计学意义（P<0.05）。根据生长曲线，我们选用48h的IC12.5，即1nM和0.5nM分别作为ECA109和TE-13细胞后续实验药物浓度。 2克隆形成实验结果显示食管癌ECA109和TE-13细胞的接种效率分别为82.7%和71.7%；ECA109及TE-13细胞的D0值和SF2值分别为3.00Gy和0.95、2.41Gy和0.93。ECA109的多烯紫杉醇（1nM）联合照射组D0值和SF2值分别为2.54Gy和0.88，TE-13的多烯紫杉醇（0.5nM）联合照射组D0值和SF2值分别2.31Gy和0.90。 3流式细胞技术检测细胞周期结果显示：正常情况下大部分细胞处于G0/G1期，其次是S期，G2/M期比例最少。给予ECA109和TE-13细胞单纯药物、单纯照射、药物加照射处理后12h、24h、48h均引起细胞G2/M期比例的增加和G0/G1期比例的下降。单纯药物作用细胞后，G2/M期比例的增加和G0/G1期比例的下降较早，并于12h时变化最明显，而后逐渐恢复，至48h与空白对照组未见明显差别（P>0.05）；4Gy照射细胞后，细胞也表现为G2/M期比例的增加和G0/G1期比例的下降，但较单纯药物组变化较晚，且恢复也较慢，48h时仍未恢复至正常（P<0.05）；12h、24h、48h时，药物加照射组的G0/G1期比例较单纯药物组和单纯照射组显著下降（P<0.05），G2/M期比例则较单纯药物组和单纯照射组显著增加（P<0.05）。12h、24h、48h时S期细胞比例变化趋势不明显。细胞凋亡结果显示：给予ECA109细胞单纯药物、单纯照射、药物加照射处理后12h，各处理组凋亡指数均未见明显变化（P>0.05），观察至24h、48h，与空白对照组比较，单纯照射组仍未见明显差别（P>0.05），单纯药物组和药物加照射组的凋亡指数明显增加（P＜0.05），且药物加照射组高于单纯药物组（P＜0.05）；给予TE-13细胞单纯药物、单纯照射、药物加照射处理后12h、24h、48h，与空白对照组比较，单纯照射组凋亡指数在各时间点均未见明显变化（P>0.05），单纯药物组和药物加照射组的凋亡指数在各时间点均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；且药物加照射组显著高于单纯药物组（P＜0.05）。 4western blotting技术检测多烯紫杉醇（1nM）对4Gy照射食管癌ECA109细胞24h后结果显示：单纯照射组、单纯药物组和药物加照射组p21蛋白表达水平均高于空白对照组，且差别具有统计学意义（P<0.05），药物加照射组的表达量高于单纯药物组和单纯照射组（P<0.05），单纯药物组与单纯照射组之间p21的蛋白表达量未见明显统计学差异（P>0.05）；单纯照射组、单纯药物组和药物加照射组的bax蛋白表达水平均高于空白对照组，且差别具有统计学意义（P<0.05），药物加照射组显著高于单纯药物组和单纯照射组（P<0.05），单纯药物组高于单纯照射组（P<0.05）；单纯照射组、单纯药物组和药物加照射组的bcl-2蛋白表达水平显著降低，与空白对照组比较，具有统计学意义（P<0.05），各处理组间bcl-2蛋白表达未见明显差异（P>0.05）；与空白对照组比较，单纯照射组、单纯药物组和药物加照射组的bcl-2/bax比值均显著下降，差别具有统计学意义（P<0.05），药物加照射组低于单纯药物组和单纯照射组（P<0.05），单纯药物组低于单纯照射组（P<0.05）。 结论： 1多烯紫杉醇对食管癌ECA109和TE-13细胞有明显的增殖抑制作用，且呈时间-剂量依赖效应。 2多烯紫杉醇能明显增加食管癌ECA109和TE-13细胞的放射敏感性。 3多烯紫杉醇可能通过p21、bax、bcl-2等相关蛋白调节细胞周期时相分布和细胞凋亡而影响细胞放射敏感性。