湖南柑橘黄龙病检测及DNA片段克隆

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing)是由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter)引起的一种柑橘毁灭性病害，危害轻者可引起树势衰退，产量下降，品质变劣；重者可引起成片柑橘树死亡，对柑橘生产构成严重障碍。湖南与广东、广西接壤，是柑橘黄龙病偶发区。近年来，随全球气温变暖，木虱活动范围扩大，柑橘黄龙病存在潜在威胁，并且在少数柑橘产区已出现柑橘黄龙病的疑似症状，有的甚至出现大片橘树枯死和毁园的现象。为进一步了解柑桔黄龙病的发生情况及传播途径，以便及时采取有效控制措施，杜绝病源传播。本研究于2005年4月至2006年3月对全省柑橘主产区的48份材料进行了PCR检测和IR(Idione Reactio)快速检测，同时进行了PCR片段克隆、测序。 研究结果如下： 1．在前人研究的基础上，对柑橘黄龙病PCR检测技术进行改进，建立了准确、快速、灵敏、稳定、安全的柑桔黄龙病菌PCR检测体系。以夏梢的韧皮部为材料，提取的DNA较稳定，检出率高，假阳性少；筛选的引物对OL1／OL2，特异性强，稳定性好，灵敏度高。 2．自制的PCR产物纯化回收简易过滤柱，具有操作简便、快速、成本低廉、得率和产物纯度较理想、连接效果好等特点，适合一般克隆实验要求，是一种简便实用的PCR产物纯化方法。 3．本试验成功克隆了黄龙病病菌基因中的一段序列，并通过测序和序列分析表明，本研究检测出的柑橘黄龙病与Genbank中基因序号为(AY342001.1)亚洲黄龙病序列同源性为99.8％，属柑橘黄龙病亚洲种中的一员。 4．本研究在国内首次采用IR法快速检测柑橘黄龙病，结果表明，该方法在一定范围内有较高的准确性，是一种快速、简便、费用低廉、容易掌握的快速检测方法，可结合田间症状在柑橘产区进行黄龙病初步筛选检测。 5．通过PCR检测，较全面的掌握了湖南省柑桔黄龙病发生情况。从22个县(市)柑橘产区采样48份，其中检测出柑橘黄龙病16份，主要集中分布在湘南柑橘产区。与上世纪80年代发生情况相比，有向北扩大的趋势，并伴有木虱发生，可能是其主要传播途径。本研究还在湘北岳阳、华容、桃源地区的少数橘园首次检测出柑橘黄龙病，发病品种为琯溪蜜柚，但未见其他品种感病，而且没有发现木虱。据分析，可能从外省黄龙病疫区调进带毒苗木所致。