蒙花苷和肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

蒙花苷(Linarin,LIN)与苯乙醇苷(Ph G-RE)是从传统中药野菊花及肉苁蓉中提取的有效药用成分,两者具有多种药理作用,然而针对两者保护心脏及改善心肌缺血再灌注损伤方面的研究还很少报道。故本研究对H9c2心肌细胞进行低氧复氧诱导建立应激损伤细胞模型,并对大鼠离体心肌予以缺血再灌注建立动物疾病模型,应用蒙花苷对H9c2心肌细胞及大鼠离体缺血再灌注损伤心肌模型进行预处理应用苯乙醇苷对大鼠离体缺血再灌注损伤心肌模型后处理,观察两种药用成分对细胞缺氧复氧损伤及大鼠离体缺血再灌注损伤动物心肌组织的保护作用及相关机制。实验研究内容如下:1.蒙花苷(LIN)保护心肌拮抗缺血再灌注损伤的作用及相关机制1.1蒙花苷(LIN)对H9c2大鼠心肌细胞保护作用及作用机制实验方法:取LIN0.4、1.1、3、10、30、50、75及100μM加入H9c2细胞中预处理48h,MTT法检测细胞存活率确定药物剂量安全范围;取LIN3、10、30μM对H9c2细胞预处理48h后将细胞缺氧处理4h,复氧处理1h,观察LIN预处理后对缺氧复氧诱导心肌细胞凋亡的影响。检测H9c2细胞存活率;分光光度法检测LDH及Caspase-3活性;蛋白免疫印记(Western Blot)检测心肌细胞Nrf-2、p-Nrf-2、Nu-p Nrf-2、Cyto-p Nrf-2、PI3K、AKT、p-PI3K及p-AKT蛋白表达。实验结果:LIN浓度≤30μM时对H9c2细胞存活率无明显影响,为给药浓度安全范围;选取安全范围内LIN浓度3、10、30μM对H9c2心肌细胞预处理48h后低氧处理4h复氧处理1h,其细胞存活率高于Model组,并使LDH漏出减少,降低Caspase-3活性,减少缺氧/复氧引起细胞损伤及凋亡。Western Blot检测发现LIN3、10、30μM预给药处理的心肌细胞其p-Nrf-2、Nu-p Nrf-2、Cyto-p Nrf-2、p-PI3K及p-AKT蛋白表达均升高,Nrf-2、PI3K和AKT蛋白表达无明显变化,且Nu-p Nrf-2/Cyto-p Nrf-2、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT比例升高,说明LIN可能通过激活PI3K/AKT/Nrf-2信号通路发挥保护缺氧/复氧损伤的心肌细胞的作用,且在此过程中促进了Nrf-2核转移。1.2蒙花苷(LIN)作用于PI3K/AKT/Nrf-2信号通路拮抗缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡实验方法:取LIN3、10、30μM对H9c2细胞预处理48h后缺氧4h,复氧1h建立缺氧/复氧细胞模型,并进行如下分组:对照组(Vehicle-Control组)、模型组(Model组)、阳性药依达拉奉组(EDV组,30μM)、LIN-L组(3μM)、LIN-M组抑制剂(10μM)、LIN-H组(30μM)、LIN-M+IC87114组,通过使用PI3KδIC87114抑制PI3K,观察LIN对PI3K/AKT/Nrf-2信号通路的作用影响。MTT检测H9c2心肌细胞存活率;检测LDH、Caspase-3、SOD、GSH-Px活性及MDA含量等指标;应用QPCR检测心肌细胞中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的m RNA表达水平;荧光倒置显微镜观察心肌细胞内荧光强度用以反映细胞内ROS的水平;Western Blot检测心肌细胞中HO-1、NF-κB、Cyto C和Bcl-2蛋白表达情况。实验结果:使用PI3K抑制剂IC87114后,LIN保护H9c2细胞作用受抑制,细胞存活率降低;LIN-M+IC87114组与LIN-M组相比较,LDH漏出增多、Caspase-3活性及MDA含量升高,SOD及GSH-Px活性降低。用DAPI对细胞进行染色后于荧光倒置显微镜下观察发现,使用LIN处理的心肌细胞其ROS与Model组相比含量减少,以上结果表明LIN预处理心肌细胞后可以增强其抗氧化能力;QPCR检测表明LIN预处理可使IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平降低,使用IC87114后可逆转此结果,表明LIN可以抑制心肌细胞炎症反应的发生;Western Blot检测显示LIN预处理可使H9c2细胞中p-PI3K、p-AKT、p-Nrf-2、HO-1、NF-κB和Bcl-2蛋白表达上调,Cyto C蛋白表达下调,PI3K、AKT及Nrf-2蛋白水平无明显改变,但在给予IC87114后上述蛋白表达结果出现逆转,以上研究表明LIN保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤的作用可能与PI3K/AKT/Nrf-2信号通路的激活相关,1.3蒙花苷(LIN)预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的作用实验方法:大鼠随机分为7组,包括对照组(Vehicle-Control组)、Model组、阳性药依达拉奉组(EDV组,30μM)、LIN-L组(3μM)、LIN-M组(10μM)、LIN-H组(30μM)、LIN-M+IC87114组。取大鼠离体心脏灌流30 min后,停灌30 min,复灌60min建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤(I/R)模型。检测指标包括:LVSP、+dp/dtmax、CF血流动力学指标;心肌三酶AST、CK-MB及LDH活性;检测SOD、GSH-Px活性及MDA含量等氧化应激指标;测定心肌梗死面积(MIS);光镜HE染色检测心肌组织病理改变;TUNEL法检测心肌细胞凋亡率;Western Blot检测心肌组织中NF-κB、Cyto C、Bcl-2、Nrf-2及p-Nrf-2蛋白表达情况。实验结果:LIN3、10、30μM预处理后均可使LVSP、+dp/dtmax及CF等血流动力学指标升高;降低心肌中CK-MB与AST的活性,减少LDH漏出;心肌组织中MDA含量降低,SOD及GSH-Px活性增加;大鼠心肌组织结构损伤得到改善,心肌梗死面积缩小;使用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡结果显示TUNEL阳性表达减少,说明LIN预处理可抑制I/R诱导的心肌细胞凋亡;Western Blot检测显示NF-κB及Bcl-2蛋白表达上调,p-Nrf-2/Nrf-2比例升高,Cyto C表达出现下调,表明LIN可能通过激活Nrf-2信号通路调节蛋白表达,继而对大鼠心肌I/R引起的损伤起到保护作用。2.肉苁蓉苯乙醇苷(Ph G-RE)减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及相关机制实验方法:通过对离体大鼠心脏灌流30 min后,停灌30 min,复灌60min建立缺血再灌注损伤(I/R)动物模型。将大鼠随机分为3组,包括对照组(Sham组)、模型组(I/R组)及肉苁蓉苯乙醇苷组(Ph G-RE组),其中苯乙醇苷组的给药剂量为0.25 mg/m L/min。实验结束对心肌梗死面积(MIS)进行检测;进行测量LVSP、+dp/dtmax及CF血流动力学指标;检测AST、CK-MB及LDH活性;使用自动生化分析仪对心肌组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量进行检测;通过HE染色检测心肌组织病理变化;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;Western Blot检测心肌组织中Cyto C、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、Procaspase-3、AKT、GSK-3β、p-AKT及p-GSK-3β蛋白表达水平。实验结果:Ph G-RE后处理可降低心肌组织中CK-MB、LDH及AST的活性和MDA含量,升高SOD、GSH-Px活性及血流动力学指标LVSP、+dp/dtmax及CF,提示Ph G-RE后处理能够改善心肌组织抗氧化能力,改善缺血再灌注损伤心肌功能;Ph G-RE减少缺血再灌注损伤心肌组织TUNEL染色阳性细胞数量,心肌结构损伤得到改善,梗死面积缩小,表明Ph G-RE可抑制I/R诱导的细胞凋亡;Western Blot结果显示Ph G-RE上调心肌组织中p-AKT、p-GSK-3β及Bcl-2蛋白的表达,升高Bcl-2/Bax比例,下调了Cyto C、Bax及cleaved-caspase-3蛋白表达,表明Ph G-RE对I/R诱导心肌损伤的保护作用可能与线粒体途径及激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路有关。3.实验结论:本实验研究表明蒙花苷可能通过激活PI3K/AKT/Nrf-2,使Nrf-2活化引起NF-κB和Bcl-2表达上调,减少线粒体中Cyto C的释放;Ph G-RE可能通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路抑制心肌细胞凋亡,蒙花苷和苯乙醇苷均能够抑制心肌组织因缺血再灌注损伤而引起的细胞凋亡,发挥心脏保护作用。