甘露糖受体MR参与隐球菌免疫逃逸及S100A10促进隐球菌穿过血脑屏障的机制研究

隐球菌系环境腐生菌，常引起免疫功能低下人群的感染，隐球菌性脑膜炎/脑膜脑炎是其高病死率的最主要的原因。隐球菌感染一般有两个结局，一是宿主免疫反应清除隐球菌，另一个就是隐球菌成功逃逸机体的免疫应答，从而造成潜伏感染或播撒。目前认为隐球菌逃逸机体的免疫杀伤有以下几个途径：1、“吞噬体挤出”与细胞内复制；2、溶解巨噬细胞或诱导巨噬细胞凋亡；3、避免被巨噬细胞吞噬；4、遮盖病原体相关分子模式（PAMP），避免宿主免疫识别；5、诱导机体免疫抑制。 甘露糖受体（Mannose receptor，MR）也叫CD206，主要由巨噬细胞及树突状细胞表达，属于C型凝集素样受体，是一种模式识别受体，不仅可以识别并结合病原生物的多种糖蛋白，介导固有免疫应答，而且通过其抗原提呈等功能，可以促进T细胞活化和细胞因子释放，启动适应性免疫应答。新生隐球菌甘露糖蛋白（Mannoprotein，MP）是MR的配体，MP可有效激活机体T细胞免疫应答，增强小鼠的抗隐球菌感染免疫，表现在MP免疫小鼠可以延长其新生隐球菌感染后的生存时间和降低器官的真菌荷载，且DCs可以通过MR和FC受体吞噬隐球菌，进而递呈抗原给T细胞，诱发机体的抗隐球菌免疫应答。目前有关隐球菌逃逸机体免疫应答的研究主要集中在隐球菌荚膜相关基因及隐球菌巨噬细胞内复制，而对于隐球菌是否通过影响某些重要受体的表达从而抑制免疫细胞的功能尚未见相关报道。鉴于MR在抗隐球菌感染免疫的重要作用，我们观察了隐球菌对MR的表达调节及其调节机制，并对其病理生理意义进行了研究。 隐球菌困扰人类的另一大问题就是其嗜中枢性，常表现为致命性的脑膜炎/脑膜脑炎。目前认为隐球菌嗜中枢性与以下因素有关：1、依赖于单核细胞的木马机制；2、活化Rho GTPases；3、活化尿激酶纤溶酶原系统；4、新生隐球菌CPS1基因透明质酸CD44分子；5、自身的尿素酶。我们前期研究发现隐球菌可以上调人脐静脉内皮细胞S100A10的表达，且抑制S100A10表达降低了脑微血管内皮细胞吞噬隐球菌的能力，被吞噬的隐球菌出芽率降低，荚膜增厚，表明沉默S100A10蛋白的表达降低了隐球菌在脑微血管内皮细胞内的生存能力，提示S100A10可能与隐球菌入侵脑微血管内皮细胞有关。因为尿激酶活化的纤溶酶系统有助于隐球菌通过血脑屏障，而纤溶酶系统的活化需要内皮细胞S100A10的参与，因此，我们对隐球菌上调脑微血管内皮细胞S100A10表达的病理生理意义进行了深入的研究，拟明确隐球菌上调S100A10的表达与其通过血脑屏障的关系。 一、隐球菌调节MR表达及其相关机制研究 首先我们观察了隐球菌对免疫细胞MR的表达的调节，我们发现隐球菌可以下调DCs及巨噬细胞MR基因水平及蛋白水平的表达，MR表达的下调并不是由于膜MR脱落成可溶性SMR所致，而是基因水平的下降。有趣的是，使用Transwell小室将菌体与细胞隔开并没有观察到这种变化，说明隐球菌下调MR的表达依赖于菌体与细胞的直接接触，但与菌的活力无关。进一步研究发现，MR的配体MP可以下调MR的表达，这一现象类似于LPS下调TLR4的表达，而后者被认为是导致内毒素耐受的机制之一，这可能是隐球菌逃逸机体免疫的一种手段。 二、MR信号转导通路的研究 因MR胞内段缺乏ITAM模序，因此我们推测MP作用于MR启动的信号通路的活化需要其他受体的参与。首先我们观察了MP刺激后巨噬细胞MAPK、NF κB的活化情况，我们发现，MP可以促进巨噬细胞p38、ERK、JNK、p65的磷酸化，敲除TLR2后上述信号通路的磷酸化均明显受到影响，说明TLR2参与了MR的信号转导。进一步研究发现，敲除TLR2明显降低了MR促进的巨噬细胞IL6、TNF α、IL1β等促炎细胞因子的分泌，并且降低了巨噬细胞杀伤隐球菌的能力，说明TLR2在巨噬细胞抗隐球菌感染免疫中具有重要的作用。应用p38抑制剂我们发现，隐球菌和MP下调MR的作用被抑制，因此，隐球菌下调MR的表达是通过活化p38MAPK实现的。 三、隐球菌下调MR表达的病理生理意义研究 由于观察到隐球菌可以下调MR的表达，因此我们探索了该现象的病理生理意义。我们发现过表达MR的DCs抗原递呈MP的能力明显增强，活化T细胞的能力也增强，说明DCs的抗隐球菌免疫能力与MR的表达水平呈正相关。接下来我们观察了降低MR表达对巨噬细胞功能的影响，我们发现，抑制MR的表达降低了巨噬细胞吞噬和杀伤隐球菌的能力，说明巨噬细胞抗隐球菌感染免疫的能力也与MR的表达水平呈正相关。因此，我们认为，隐球菌下调MR的表达抑制了机体的免疫应答，从而逃避机体的抗隐球菌免疫反应，这可能是隐球菌免疫逃逸的一个新的机制。 四、S100A10与隐球菌嗜中枢性的机制研究 我们的前期研究发现，隐球菌可以上调人脐静脉内皮细胞S100A10的表达，抑制S100A10的表达明显降低了内皮细胞吞噬隐球菌的能力,并且被吞噬的隐球菌出芽率降低、荚膜变厚，说明S100A10可能在隐球菌侵袭血管内皮细胞的过程中具有重要作用。我们的研究发现，隐球菌可以上调小鼠脑微血管内皮细胞S100A10的表达，通过干扰慢病毒载体沉默S100A10的表达降低了依赖于纤溶酶的隐球菌通过血脑屏障的能力，但对未包被纤溶酶原的隐球菌通过血脑屏障的能力影响不大，说明S100A10影响隐球菌通过血脑屏障依赖于纤溶酶原的存在。进一步的研究发现，沉默S100A10的表达降低了尿激酶及纤溶酶原的活化，而升高的尿激酶纤溶酶的活性被认为与隐球菌侵袭血脑屏障有关，因此，隐球菌促进S100A10尿激酶纤溶酶系统的活化可能与其嗜中枢性有关。 综上所述，我们发现了隐球菌可以下调MR的表达，MR表达的降低可能是隐球菌诱导免疫细胞的功能抑制的一个新的途径，而隐球菌上调S100A10的表达与其嗜中枢性有关，下一步研究可通过构建MR转基因小鼠和S100A10基因敲除小鼠进一步从体内予以证实。