亚硝酸还原酶产生菌的筛选、发酵优化以及酶学性质研究

亚硝酸盐广泛存在于植物、水体以及食品中,与我们生活息息相关。作为一种有害物质,亚硝酸盐可致毒、致癌、致畸。能否有效控制亚硝酸盐的含量,减小危害已经成为人们亟待解决的问题。如今,亚硝酸盐引起广泛关注,很多国家也开始致力于通过各种方法来控制食品中亚硝酸盐的使用量,化学、生物技术的方法是目前研究较多的,用以降低亚硝酸盐含量,较小亚硝酸盐带来的危害。其中,生物方法具有独特的优势,因而许多研究倾向于生物方法,主要是利用微生物可降解亚硝酸盐的特性或其产生的亚硝酸盐还原酶可以用来降低亚硝酸盐含量,这种方法也是目前的研究热点与重点。本文从大学城华南理工大学校园筛选得到一株产亚硝酸还原酶菌株,通过对其进行形态学观察和16S r DNA测序分析,构建系统发育树,最终确定为芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp C。以筛选得到的Bacillus sp C为出发菌株,对培养基成分进行了单因素和响应面优化,优化培养基组成如下:葡萄糖2.26%,蛋白胨0.2%,NH4Cl 0.12%,K2HPO4·H2O 0.2%,Mg SO4 0.075%,KCl 0.1%,Fe SO4 0.004%,Na NO2 0.2%。通过对发酵条件进行单因素优化,得到最佳培养条件:温度30℃,p H 7.0,转速180 r/min,接种量3%。在此最优条件下,酶活达到319.43 U/ml,较优化前190.26 U/ml提高了67.89%。经过粗酶液的酶学性质研究表明:该亚硝酸还原酶酶促反应最适p H为7.4,在p H值为6.6～8.0时,相对酶活力都在65%以上;最适温度为30℃,在温度低于70℃时,剩余酶活力在70%以上;金属离子对亚硝酸还原酶活力的激活作用大小分别为Mn2+>Mg2+>Na+>Ni2+>K+>Ba2+>Zn2+,其中Mn2+的激活作用最强,酶活力提高了57%,其次是Mg2+和Na+,分别提高了38%和37%;研究得到金属离子和EDTA对酶活力的抑制作用大小分别为:Fe2+>EDTA>Cu2+>Co2+,其中Fe2+抑制作用最强,使酶活力降低了52%,EDTA使酶活力降低了50%,Cu2+使酶活降低了27%,Co2+使酶活降低了24%。