氨肽酶作为重要的外肽酶,具有非常重要的工业应用价值,能够既有效又环保地对蛋白质进行相关的水解反应,切除致苦味的基团,去除蛋白质的苦味,在食品、工业、医药等方面具有重要的研究价值和应用价值。
本文从豆豉中分离筛选出产氨肽酶能力高的菌株,经形态特征,培养特征以及生理生化特征分析研究,并通过分子鉴定和16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为芽孢杆菌属,与嗜甲基芽孢杆菌的进化亲缘关系最近,16S rDNA相似性达到100%,经鉴定,该菌株中文命名为甲基营养型芽孢杆菌CC(Bacillus methylotrophicus CC),英文命名为Bacillusmethylotrophicus CC。
氨肽酶能从多肽链的N端顺序水解并释放氨基酸,本文利用单因素试验、正交试验及响应面设计试验方法,优化了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) CC发酵产氨肽酶的条件。其发酵最佳培养基组成为:1%蔗糖、1.5%黄豆饼粉、0.1%氯化钠、0.05%磷酸二氢钾、0.02%硫酸镁和0.01%氯化钴。最适发酵条件为:初始pH值为8.5,发酵温度37℃,摇床转速180r/min,接种量6%,发酵时间15h。在上述条件下,氨肽酶的产量从优化前的83.09U/ml提高到469.35U/ml,比优化前增加了4.65倍。
通过对氨肽酶酶学性质进行了研究,结果表明:该菌株发酵生长4h后就达到对数期,17h达到最大,产氨肽酶的最佳时间在培养的15h,氨肽酶的最高酶活力为474.52U/ml,最适温度为50℃,最适范围pH9.0,具有较好的热稳定性和pH稳定性,50℃条件下60min仍保持62.78%的酶活,60℃条件下30min仍保持56.50%的酶活,70℃条件下,15min仍保持55.93%的酶活,pH为8-10时可保持较高的酶活力。不同浓度的Co2+、Zn2+对氨肽酶活性具有明显的促进作用,而不同浓度的Fe2+、Mg2+、Ca2+对氨肽酶活性具有明显的抑制作用,K+对该氨肽酶酶活性影响不大。该氨肽酶对DTT最为敏感,PMSF、1,10-Phenantroline、EDTA、IAA等抑制剂对该氨肽酶均有不同程度的抑制作用。该氨肽酶对精氨酸和亮氨酸都具有良好的底物特异性,且亮氨酸氨肽酶分子量为53KD左右。
本研究经过分子鉴定,确定了该菌株的种属关系,优化了甲基营养型芽孢杆菌产氨肽酶的发酵优化条件和发酵培养基,提高了氨肽酶的表达量,通过对其生物化学性质进行了深入研究,期望在此方面所做的研究工作能为氨肽酶的产业化创造基础,并为大规模生产提供科学依据。