环境毒性物质MPTP导致多巴胺能神经元损伤机理研究

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是中老年常见的神经退行性疾病。其病因主要有遗传因素、环境因素。临床症状有静止震颤、运动迟缓、步态不稳、肌肉僵直,严重时伴有认知障碍,其病理表现和生化改变主要是纹状体黑质多巴胺能神经元的丢失以及神经元胞浆中路易小体的积聚,引起多巴胺分泌不足,纹状体多巴胺水平下降,多巴胺与乙酰胆碱比值下降。目前,帕金森病主要的治疗方法为左旋多巴胺的替代治疗,然而治疗效果不佳,其原因在于帕金森病的发病机理还不清楚。 帕金森病机理的研究依赖于成功的细胞模型和动物模型建立,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)是常用的制备帕金森小鼠模型药物,1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinum ion, MPP+)是MPTP的活性代谢产物,MPTP在单胺氧化酶作用下生产MPP+, MPP+被多巴胺转运体摄取到多巴胺神经元内,与线粒体呼吸链复合物Ⅰ结合并抑制其活性,致使神经元ATP产生减少,自由基增多,最终导致神经元死亡 除了线粒体受损和自由基产生增多,帕金森病理表现还有神经元胞浆中异常蛋白.形成路易小体(Lewy's body)的积聚。蛋白质的代谢与内质网密切相关,因此,内质网应激(ER stress)在帕金森病的发生、发展过程中起重要的作用。葡萄糖调节蛋白78(binding protein/glucose-regulated protein 78, BiP/Grp78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP、caspase-12以及Irel肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2)、细胞凋亡信号调节激酶l(Apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)等参与了内质网应激。此外,内质网应激还与磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K)／蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)活性降低和糖原合酶激酶3(3(glycogen synthase kinase 3p, GSK-3β)活性增加有关。 硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一个小分子氧化还原蛋白,其主要功能有清除活性氧自由基、调节转录因子、抗细胞凋亡及神经营养作用等。硫氧还蛋白具有保护多巴胺能神经元免受MPTP所致内质网应激损伤,然而这一作用的分子机理还不十分清楚。因此,进一步明确硫氧还蛋白调节内质网应激的作用机理,有助于进一步明确帕金森病的发病机制,同时为帕金森病的治疗提供靶点。 本论文用(?)1PTP/MPP+建立帕金森病模型,探索帕金森病发病的内质网应激机制以及硫氧还蛋白在保护多巴胺能神经元免于帕金森病毒性物损伤的分子机制。 主要的研究结果如下： MPP+刺激PC12细胞后,PC12活性呈剂量依赖降低,LDH的释放增加。MPP+刺激PC12细胞后,诱导了BiP/Grp78和CHOP的表达以及pro-caspase-12的降低,且BiP/Grp78的表达要先于CHOP及caspase-12的活化。这些结果说明MPP+引起的PC12细胞凋亡与内质网应激有关,在内质网应激发生初期BiP/Grp78表达增加是缓解内质网应激的保护机制,直到CHOP和caspase-12的活化。 PI3K的激动剂NGF以及GSK-3β抑制剂LiCl抑制了MPP+诱导BiP/Grp78和CHOP的表达以及caspase-12的活化。MPP+刺激PC12细胞,pAkt (ser 473)和pGSK-3β(ser 9)的表达均明显下降。说明MPP+使pAkt的473位丝氨酸去磷酸化后,其激酶活性被抑制,而GSK-3β的9位丝氨酸去磷酸化后则被激活,从而引起细胞凋亡。NGF预刺激可以抑制GSK-3p的活化。这些结果表明PI3K/Akt/GSK-3p参与了MPP+诱导的PC12细胞内质网应激过程。 通过转染Trx的小RNA干扰片段,下调PC12细胞硫氧还蛋白的表达,发现硫氧还蛋白低表达对MPP+诱导的BiP/Grp78和CHOP表达没有显著的影响,但是加剧了内质网特异性蛋白酶caspase-12的活化。另一方面,实验通过硫氧还蛋白诱导物替普瑞酮(geranylgeranylacetone, GGA)预刺激PC12细胞,诱导硫氧还蛋白高表达后,抑制了MPP+诱导的BiP/Grp78和CHOP表达增加以及caspase-12的活化。这些结果说明GGA诱导的硫氧还蛋白高表达可以抑制内质网应激,从而,降低MPP+诱导的细胞凋亡。因此,硫氧还蛋白具有抑制MPP+诱导的PC12细胞内质网应激的作用。 三七三醇组皂苷(Panaxatriol saponins, PTS)是三七的主要活性成分,具有抗氧化、保护脑组织、抗血栓等功效。PTS也是硫氧还蛋白的诱导物之一,可以诱导PC12细胞以及小鼠的硫氧还蛋白表达。PTS预刺激可以抑制MPP+引起的PC12细胞损伤。在小鼠实验中,自主运动实验结果为MPTP组小鼠运动能力明显低于生理盐水对照组小鼠,而PTS预刺激后,小鼠的运动能力则得到显著改善。说明PTS明显改善了MPTP引起的小鼠运动障碍。在小鼠肢体损伤评估中也发现,PTS预刺激可以改善MPTP引起的小鼠肢体损伤。这些结果说明PTS对MPTP引起的小鼠运动障碍及肢体损伤具有保护作用。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺能神经元的标记蛋白之一,实验结果表明MPTP组小鼠黑质酪氨酸羟化酶的表达明显减少,说明MPTP导致小鼠黑质多巴胺能神经元坏死丢失。PTS可以恢复MPTP引起的酪氨酸羟化酶减少,说明PTS可以抑制MPTP所致的多巴胺能神经元坏死丢失。实验发现MPTP明显下调了黑质硫氧还蛋白的表达,PTS可以抑制MPTP引起的硫氧还蛋白下调。PTS通过诱导硫氧还蛋白改善小鼠黑质多巴胺能神经元损伤,从而起到神经保护作用。实验结果还发现MPTP激活了caspase-9、caspase-3的活性,从而引起多巴胺能神经元凋亡,PTS则抑制了MPTP引起的caspase-9和caspase-3活化。说明PTS通过抑制caspase-9和caspase-3的活化,保护多巴胺能神经元免受MPTP神经毒性损伤,但PTS预刺激并不能抑制MPTP对caspase-12的活化作用。这一结果说明PTS保护多巴胺能神经元免受MPTP神经毒性损伤通过了线粒体途径。实验结果显示MPTP诱导了小鼠黑质环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的表达,而PTS抑制了这一过程。这些结果说明PTS能改善MPTP诱导的小鼠运动障碍,防止黑质多巴胺能神经元坏死丢失。其主要机理为PTS诱导硫氧还蛋白表达,抑制促炎因子COX-2的过表达,抑制线粒体介导的神经元凋亡途径。 以上结果表明：内质网应激介导的神经细胞凋亡在帕金森病进程中起着重要作用,而且PI3K/Akt/GSK-3β信号通路参与了MPP+诱导的内质网应激过程。这一发现揭示了MPP+引起神经元凋亡线粒体途径外的内质网应激途径,进一步阐明了帕金森病发病机理。在细胞水平,硫氧还蛋白诱导物GGA可以缓解MPP+引起的内质网应激,从而抑制细胞凋亡。PI3K/Akt/GSK-3p所介导的内质网应激是帕金森病潜在的重要干预靶点。另一方面,在活体动物实验中,硫氧还蛋白诱导物PTS通过诱导硫氧还蛋白的表达,抑制了炎症反应以及线粒体损伤介导的神经元凋亡。实验结果为寻找帕金森病潜在治疗靶点提供了新的理论基础依据。硫氧还蛋白诱导物如GGA、PTS等可能是良好的帕金森病预防和治疗药物,对帕金森病的防治具有重要的理论价值和现实意义。本研究为寻找帕金森病潜在治疗靶点提供了新的理论基础依据。硫氧还蛋白诱导物可能是帕金森病预防和治疗药物。该研究对帕金森病的防治具有重要的理论价值和现实意义。