基于Label free蛋白质组学和LC-Q-TOF-MS代谢组学的四君子汤干预脾虚证机制研究

脾虚证是中(兽)医临床常见证候,主要以消瘦,倦怠,懒动,神疲和消化不良为主要症状。传统中(兽)医对其有较好的治疗作用,但有关脾虚证过程蛋白质组学和代谢组学的研究较少,对其现代科学的物质基础不甚清楚。四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草等四味中药组成,是中(兽)医临床用于治疗脾虚证的经典名方,如何用现代语言阐释中(兽)药复方的药效物质基础和作用机制一直是研究的难点。本论文采用利血平法复制脾虚证大鼠模型,首先通过药效学研究评估四君子汤对脾虚证的干预效果。然后采用非标记定量(Label free)蛋白质组学和液相色谱-四级杆-飞行时间-质谱联用(LC-Q-TOF-MS)代谢组学方法,对比研究脾虚证和四君子汤干预脾虚证大鼠肝脏差异表达蛋白谱和血浆、肝脏差异代谢物谱,筛选出脾虚证和四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白和差异代谢物,最后采用生物信息学方法对差异表达蛋白和差异代谢物分别进行分析,挖掘脾虚证和四君子汤干预脾虚证可能的靶标蛋白和潜在生物标志物,并建立相应的生物分子代谢通路和相互作用网络。从蛋白质组学和代谢组学层面揭示四君子汤干预脾虚证的作用机制,以期为有效地指导脾虚证的临床诊断和治疗提供科学依据。本研究的具体内容和结果如下:1.四君子汤干预脾虚证的药效学研究40只SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、模型组(M组)、四君子汤干预组(SJZD组)和阳性对照组(PC组),采用利血平法复制脾虚证大鼠模型,观察大鼠的临床体征变化,检测脏器指数、生理生化指标,行为学指标,并对胃、十二指肠、脾脏、肝脏等组织进行病理学观察。结果表明,与正常对照组相比,模型组大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、胃蛋白酶、肝脏琥珀酸脱氢酶、肝脏Ca2+Mg2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶等酶活性和血清及胃中胃泌素、饥饿素等含量均明显下降(P<0.05),而血清和肝脏中乳酸脱氢酶活性均明显上升(P<0.05)。与模型组相比,四君子汤干预组和阳性对照组上述指标的活性和含量分别显著回升或下降(P<0.05)。旷场实验显示,与正常对照组相比,模型组大鼠水平爬行格数和直立次数均极显著降低(P<0.01),与模型组相比,四君子汤干预组和阳性对照组大鼠水平爬行格数和直立次数均极显著升高(P<0.01)。组织病理学检查结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠胃、十二指肠、脾脏、肝脏等组织均有不同程度的病理改变,与模型组相比,四君子汤干预组和阳性对照组大鼠上述组织的病理改变明显减轻或恢复正常。以上结果提示:四君子汤对大鼠脾虚证具有较明显的干预效果。2.肝脏蛋白质组学研究采用Label free蛋白质组学技术分析各组模型大鼠肝脏组织蛋白表达谱的变化并按差异倍数>1.5(<0.67),筛选脾虚证和四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白,并对差异表达蛋白进行Gene Ontology(GO)注释和富集、Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes(KEGG)注释和富集及蛋白质相互作用网络分析。结果显示,筛选出脾虚证的差异表达蛋白267个(上调125个,下调142个),四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白247个(上调81个,下调166个)。GO富集分析表明,脾虚证和四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白主要分布在细胞质、细胞膜和胞外区部分;主要参与各种代谢过程;脾虚证的差异表达蛋白主要功能体现在结合活性和酶活性方面,四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白主要分子功能为酶催化,转化和转移方面。通过对比分析KEGG富集到的脾虚证和四君子汤干预脾虚证的差异表达蛋白参与的靶标路径,表明四君子汤干预大鼠脾虚证的机制主要是通过对胆汁酸分泌、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、脂肪酸代谢等4条代谢通路的调节实现的。蛋白质相互作用网络分析显示差异表达蛋白参与多种生物学功能和代谢通路,与GO注释和KEGG注释结果相一致。3.血清和肝脏代谢组学研究采用LC-Q-TOF-MS代谢组学技术获得血清和肝脏组织的代谢轮廓,采用模式识别等统计方法进行分析,筛选模型大鼠血清及肝脏组织差异代谢物,并对差异代谢物进行相关性、热图、代谢通路和代谢物相互作用网路分析。结果显示,模型组和正常对照组大鼠代谢轮廓完全分离,而四君子汤干预组和阳性对照组均向正常对照组靠近。根据VIP>1.0和P<0.05双重指标筛选出脾虚证潜在生物标志物66个(血浆20个,肝脏46个),四君子汤干预脾虚证潜在生物标志物81个(血浆34个,肝脏47个)。采用Met PA数据库构建潜在生物标志物参与的代谢通路,选择Impact>0.10的代谢通路为靶标通路,通过对比分析脾虚证和四君子汤干预脾虚证的潜在生物标志物参与的靶标通路,表明四君子汤干预大鼠脾虚证的机制主要是通过对甘油磷脂代谢、脂肪酸在线粒体中的延长、酮体的合成和降解、脂肪酸代谢、醚脂代谢、萜类物质骨架合成、缬氨酸,亮氨和异亮氨酸降解、丁酸甲酯代谢等8条代谢通路的调节实现的。构建了潜在生物标志物的相互作用网络,筛选出了Acetyl-Co A,3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A和Hexanoyl-Co A等3个与四君子汤干预大鼠脾虚证相关性极强的潜在生物标志物。综上所述,健脾益气基础方四君子汤可不同程度的减缓脾虚证模型大鼠临床症状,改善失调的生理生化指标和组织器官的病理变化。蛋白质组学和代谢组学研究揭示,四君子汤分别通过胆汁酸分泌、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、脂肪酸代谢等和甘油磷脂代谢、脂肪酸在线粒体中的延长、酮体的合成和降解、脂肪酸代谢、醚脂代谢、萜类物质骨架合成、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解、丁酸甲酯代谢等代谢通路,多靶点对大鼠脾虚证进行干预。主要涉及到机体内的脂代谢、氨基酸代谢、糖代谢等主要营养物质的代谢过程,其中脂肪酸代谢为四君子汤主要的靶代谢途径。本研究为脾虚证实质的揭示和四君子汤干预脾虚证机制的研究提供了理论依据。