桂枝芍药知母汤对Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠作用机制的实验研究

研究目的:类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病,以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA的发病率在我国约为0.4%,全球为0.5%～1.0%。半个世纪以来,关于RA的发病机制一直处在不断的发展变化中。其中滑膜细胞、软骨细胞、巨噬细胞等产生的细胞因子和滑膜细胞的类肿瘤样增生在RA免疫炎症和骨质破坏中起着重要的作用,是研究热点。中药复方桂枝芍药知母汤是金匮要略的名方,其方祛风除湿、温经散寒、滋阴清热,临床广泛使用,治疗类风湿关节炎效果显著,但其治疗机制尚不清楚。Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型(collagen-induced arthritis CIA)模型在免疫病理、临床表现、组织病理变化等方面与人RA最为接近,是目前国际公认的研究RA发病机理、治疗药物的理想动物模型。在本实验中,我们复制了Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎模型,然后从桂枝芍药知母汤对CIA大鼠的治疗作用,血清细胞因子的影响,巨噬细胞功能的影响,对CIA大鼠c-myc mRNA表达影响等方面对其机制进行研究,为临床用药提供理论依据。 实验方法:本实验主要分为三个部分,以CIA大鼠作为动物模型,探讨桂枝芍药知母汤治疗RA的作用机制。 第一部分建立CIA大鼠模型。实验动物随机分为三组,即正常对照组,CIA模型组和佐剂对照组。其中CIA模型组以含Ⅱ型胶原的完全弗氏佐剂免疫,致炎后第14天发生继发性肿胀,即右侧足肿胀。观察记录大鼠的一般状况,不同时间点各组大鼠继发侧关节的肿胀度的变化,并绘制变化曲线。在免疫42天后,断头处死大鼠,取血清,用ELISA法测定CIA大鼠血清Ⅱ型胶原抗体的含量。 第二部分实验,Wistar大鼠CIA致敏第18天后,桂枝芍药知母汤大、中剂量(37.2、18.6g/kg,分别相当于成人每日常用量的20、10倍),灌胃给药。雷公藤多甙片研成细末,加生理盐水,配成混浊液10g/kg.d,连续给药3周。正常组、CIA模型组均灌以等容积蒸馏水。给药三周后,大鼠断头处死。用Griess法测定大鼠血清中NO的水平;用胸腺细胞法测定大鼠血清IL-1的含量。用ELISA法检测TNF-α、IL-10含量的变化。用Griess法测定大鼠腹腔巨噬细胞NO产生能力;中性红比色法测定巨噬细胞的吞噬功能,胸腺细胞法测定巨噬细胞产生IL-1的能力。用ELISA法检测巨噬细胞分泌的TNF-α含量。通过以上指标的测定,来探讨桂枝芍药知母汤对RA的治疗机理。 第三部分实验用RT-PCR的方法检测CIA大鼠滑膜细胞c-myc mRNA的表达,从原癌基因的过度表达引起滑膜增生角度来探讨桂枝芍药知母汤对RA的治疗作用。 实验结果:第一部分实验发现,致炎后14天大鼠开始出现关节红肿,首先出现红肿的是右后足趾关节,然后蔓延到前足和尾部,并且日趋严重。关节肿胀于第21天达到高峰。发病过程伴随大鼠体温升高和体重减轻。随着时间的延续肿胀逐渐消退,但