胆汁淤积下TNFα上调胆酸转运蛋白OATP3A1减轻肝损伤的效应及机制初探

背景胆汁淤积是以胆汁酸在肝细胞或体循环内的过度聚积为特征的临床综合症,其病因包括:肝炎、脂肪肝、胆道阻塞、细菌感染、妊娠、基因突变或缺失等。胆汁酸转运蛋白及合成酶的适应性反应,在胆汁淤积的发病机制中发挥重要作用。在胆汁淤积的适应性反应中,下调CYP7A1、CYP8B1等胆汁酸合成酶,削减胆汁酸的合成;经上调多药耐药相关蛋白4(MRP4)、多药耐药相关蛋白3(MRP3)、有机阴离子转运多肽3A1(OATP3A1)蛋白和有机溶质转运体α/β(OSTα/β)等胆汁酸转运体,减轻肝细胞内胆汁酸淤积,减缓毒性胆汁酸对肝脏造成的伤害。在胆汁淤积症中,OATP3A1作为胆汁酸外排蛋白适应性表达上调,对巩固胆汁酸稳态有重要意义。最新证据表明,炎症不仅参与胆汁酸诱导的肝脏炎症反应,也调控胆汁淤积的适应性反应,炎症因子可影响胆汁酸转运体并参与胆汁淤积性肝损伤。我们发现肿瘤坏死因子α(TNFα)作为一种炎症因子,在人梗阻性胆汁淤积症中高表达,并且TNFα能够上调肝癌细胞株PLC/RPF/5中OATP3A1的表达,然而TNFα是否以及如何调节人胆汁淤积症中OATP3A1的表达尚不清楚。因此阐明TNFα诱导OATP3A1上调的分子机制,有望以OATP3A1作为潜在治疗靶点为胆汁淤积治疗带来新的策略。方法(1)通过构建0.1%DDC胆汁淤积小鼠模型,运用HE染色、q PCR等实验,明确Tnfα及Oatp3a1在胆汁淤积小鼠肝脏中的表达水平。(2)收集胆汁淤积病人及对照组病人的肝组织及血浆样本,应用q PCR及ELISA实验比较两组病人OATP3A1、TNFα水平,明确在胆汁淤积中OATP3A1与TNFα表达水平是否具有相关性。(3)运用细胞培养技术,使用重组TNFα刺激肝癌细胞株PLC/RPF/5、小鼠原代肝细胞,通过q PCR及Western blot实验分析,明确TNFα是否能上调细胞中OATP3A1表达。(4)研究已经发现OATP3A1启动子区域存在转录因子NFκB、Sp1的若干顺式作用元件,运用细胞核蛋白提取技术及Western blot实验,分析TNFα是否能刺激细胞核内转录因子NFκB及SP1的表达,是否能激活NFκB和ERK信号通路。(5)通过使用NFκB或ERK信号通路抑制剂处理细胞,应用q PCR及Western blot实验,验证TNFα是否通过激活NFκB和ERK信号通路上调细胞核内NFκB p65及SP1调节OATP3A1的转录与表达。结果(1)与对照组小鼠相比,Tnfα及Oatp3a1的m RNA水平在0.1%DDC胆汁淤积小鼠肝组织中上调。(2)与对照组相比,OATP3A1与TNFα在胆汁淤积病人的血浆及肝脏中高表达;且胆汁淤积患者血浆TNFα水平升高与肝脏OATP3A1 m RNA水平增高呈正相关。(3)重组TNFα能够以时间依赖性和浓度依赖性的方式刺激小鼠原代肝细胞、PLC/PRF/5肝癌细胞中OATP3A1的表达。(4)在小鼠原代肝细胞、PLC/PRF/5肝癌细胞中TNFα能够刺激转录因子SP1、NFκB p65在细胞核中的表达,并且分别呈现浓度依赖性和时间依赖性。(5)进一步机制研究发现,在PLC/PRF/5细胞中,重组TNFα以时间依赖性和浓度依赖性上调NFκB p65及ERK1/2的磷酸化水平;重组TNFα在PLC/PRF/5细胞中激活NFκB及ERK信号通路。(6)NFκB或ERK信号通路抑制剂能够阻遏TNFα上调OATP3A1蛋白水平及NFκB p65及ERK1/2磷酸化水平。结论胆汁淤积症患者肝脏OATP3A1与血浆TNFα水平升高呈正相关,TNFα通过激活NFκB p65和ERK-SP1信号通路上调OATP3A1。本文阐明了TNFα诱导OATP3A1上调的分子机制,为OATP3A1治疗胆汁淤积症奠定理论基础。