补肾活血方含药血清对卵巢颗粒细胞ActA/Smads信号通路的影响

目的：本实验以体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞为载体,研究BSHX含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞ActA/Smads信号传导通路的影响,并确定其相关作用靶点,阐明其促进卵泡发育的微观机制,从而为补肾中药的新药研究奠定实验研究基础。 方法：1.采用简单机械分离方法建立SD大鼠卵巢颗粒细胞体外培养体系,光镜下观察细胞生长情况,采用FSHR免疫组化及HE染色法进行细胞鉴定；2.随机分成8组,每组设12个复孔,即1%、5%、10%、15%、20%不同浓度含药血清培养液组(含药血清取中剂量组),FSH25ng/ml,10%胎牛血清培养液组,无血清培养液组,100ul/孔,48h后检测OD值,确定最适浓度,另收集上清液测定不同浓度下48h后E2、P分泌量；3.随机分成6组,即：15%BSHX含药血清高、中、低剂量组、15%生理盐水含药血清组、25ng/mlFSH含药血清组以及无血清DMEN/F12培养液空白组,分别于1h、2h、6h、12h、24h、48h后ELISA法测定ActA分泌量及免疫组化SP法测定ActRⅡA、Smad2、Smad3表达量。 结果：1.体外培养的卵巢颗粒细胞生长良好,12h后长出伪足,3-4d进入增生期,14d左右细胞凋亡明显,FSHR免疫组化阳性染色：核呈蓝紫色,浆呈棕黄色,且阳性率大于95%,HE染色：核呈深蓝色,胞浆呈淡红色；2. BSHX含药血清最适浓度为15%,p<0.05,各组差异有统计学意义；48h后15%BSHX含药血清E2分泌量最为明显,p<0.05,各组差异有统计学意义；p分泌变化无统计学意义,p>0.05；3.各BSHX含药血清组ActA分泌量与时间存在一定的依赖性,12h后出现峰值,最佳剂量为中剂量组；各BSHX含药血清组中ActⅡA染色主要位于胞浆,而Smad2、Smad3染色主要位于细胞核,且均与时间存在一定的依赖性,12h后出现峰值。 结论：BSHX含药血清能促进体外培养的卵巢颗粒细胞增殖和分化,促进其E2的分泌。通过促进ActA的分泌量和上调ActRⅡA、Smad2、Smad3表达来影响ActA/Smads信号通路的传导。