巴戟天寡糖对大鼠成肌细胞增殖及分化的影响

目前治疗心肌梗死的手段如溶栓药物治疗、经皮冠状动脉腔内成形术与冠状动脉旁路移植术等可在一定程度上恢复梗死区域血流，但不能挽救已坏死的心肌。随着病程的进展，坏死区心肌逐渐由无收缩功能的纤维母细胞和胶原组织替代产生心肌重塑。成人心肌细胞为终末分化的细胞，几乎无再生能力，无法通过诱导周边心肌细胞的增殖来修补坏死区心肌。近年来的研究表明，以正常肌细胞取代疤痕组织，限制心肌梗死的延展及预防心衰的发生发展，可能是一种极具前景的临床治疗手段。同时，中药在促进细胞增殖方面的研究也取得了很大进展。巴戟天（Morinda Officinalis How）是一种传统的温补壮阳药物，导师组近年来一直致力于它对心脏保护作用的研究。但巴戟天寡糖（Morinda Officinalis How Oligosaccharide）对成肌细胞增殖分化的研究，目前尚未见报道。由于存在于骨骼肌基底膜下的成肌细胞作为肌组织前体细胞，具有定向分化为骨骼肌或心肌细胞的潜力。所以我们在以往的研究基础上，采用离体纯化培养乳鼠双侧后肢骨骼肌成肌细胞的方法观察巴戟天寡糖对其增殖及分化的影响。 研究方法 实验采用出生1～3d的SD大鼠，无菌条件下剪取后肢骨骼肌，PBS缓冲液冲洗后用0.05％Ⅱ型胶原酶和0.125％胰蛋白酶消化，收集成肌细胞悬液，差速贴壁法纯化后制成浓度为1×10～5／mm3的细胞悬液，接种到25ml培养瓶中培养。实验分为5组：（1）空白对照组；（2）5-氮杂胞苷（5-Aza） （10μmol／mL）阳性对照组；（3）巴戟天寡糖小浓度（100μg／ml）组；（4）巴戟天寡糖中浓度（300μg／ml）组；（5）巴戟天寡糖大浓度（500μg／ml）组。分别检测以下指标：①成肌细胞形态学变化。②免疫细胞化学法鉴定结蛋白（Desmin）。③免疫细胞化学法测定转化生长因子β1（TGF-β1）和增殖细胞核抗原（PCNA）。④四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测巴戟天寡糖对成肌细胞增殖的影响。⑤绘制生长曲线。 结果 1．成肌细胞形态学变化倒置显微镜下观察，正常成肌细胞培养24 h后，可见大量折光率强的圆形细胞贴壁，且有极少量细胞有小突起。48 h后，见大量梭形单个核细胞出现，其中易混杂有少量扁平、多突起、胞浆丰富的单个核贴壁成纤维细胞。72h后，梭形细胞的数量逐渐增加，成肌细胞变得细长，并相互拉网，此时表明培养的成肌细胞从单个核期进入合体细胞阶段。继续培养，大量增殖的成肌细胞相互融合，形成核位于中央的多核性长管状初生肌管，肌管形成的时间不一，有的细胞相对缓慢。此后肌管数量增多、体积增大，核数也明显增多。培养第5天后，在镜下可观察到分化状态较好的肌管有自发性搏动的收缩现象。 2．免疫细胞化学法鉴定Desmin用Desmin抗体对分裂增殖4～5d的成肌细胞及对照组的成纤维细胞进行间接免疫酶染色。图像结果显示：成肌细胞的核外周及胞浆呈棕黄色，为阳性反应；对照组的成纤维细胞的胞浆不着色，呈阴性反应。这表明培养的细胞为成肌细胞。 3．免疫细胞化学法测定TGF-β1及分析其图像用免疫细胞化学法测定加药后分裂增殖6～7d的成肌细胞内TGF-β1的表达。图像结果显示：空白对照组和阳性对照组多数单核成肌细胞及多核初生肌管内的胞浆中TGF-β1均呈弱阳性反应；巴戟天寡糖100μg／ml和500μg／ml两组单核成肌细胞及多核初生肌管内的胞浆中TGF-β1均呈阳性反应；300μg／ml组的单核成肌细胞及多核初生肌管内的胞浆中TGF-β1呈强阳性反应。结果表明在一定浓度范围内，巴戟天寡糖对成肌细胞内TGF-β1的表达有增强作用，但过大浓度时反而抑制其表达。 4．免疫细胞化学法测定PCNA及分析其图像用免疫细胞化学法测定加药后分裂增殖6～7d的成肌细胞内PCNA的表达。图像结果显示：空白对照组和阳性对照组多数单核成肌细胞核均呈PCNA弱阳性反应；巴戟天寡糖100μg／ml和300μg／ml两组多数单核成肌细胞核均呈PCNA阳性反应；500μg／ml组多数单核成肌细胞核呈PCNA强阳性反应。结果表明在一定浓度范围内，巴戟天寡糖浓度组成肌细胞细胞核的PCNA阳性反应均较对照组强，且随浓度递增而渐呈强阳性反应。 5．MTT检测巴戟天寡糖对成肌细胞增殖的影响巴戟天寡糖对成肌细胞增殖呈浓度依赖性，且各组与对照组相比均有显著差异，在500μg／ml浓度达到最大效应（P＜0.05）。 6．绘制生长曲线原代成肌细胞生长培养48 h后开始增生，早期增殖较快，倍增时间为5d，6、7d进入平稳期。 结论 1．巴戟天寡糖具有明显促进成肌细胞增殖及分化的作用。 2．巴戟天寡糖可在一定浓度范围内增加成肌细胞的TGF-β1表达，但是浓度过高反而抑制其表达，其原因还需进一步深入探讨。 3．PCNA可作为成肌细胞增殖的一种标志物。