丰富环境干预对新生大鼠HIBD的神经康复作用及其机制的研究

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是新生儿时期的危重疾患，常导致患儿死亡，幸存者也易遗留神经系统后遗症。临床上的治疗仅限于支持对症处理，尚缺乏有效的治疗方法。目前，国内外的研究证实，对于HIBD患儿在康复期进行早期干预可以改善神经行为预后，减轻神经系统后遗症。 目前我们对于神经康复以及早期干预的机理仍然知之甚少。作为早期干预的动物模型，HIBD大鼠的丰富环境干预模型为我们开启了一扇了解早期干预机制的窗口。丰富环境包括丰富多变的饲养环境、较多的自发运动以及个体间密切交往等因素。具体来说丰富环境应该有较大的笼舍，内有玩具，如梯子、滚轮、绳子、平台、隧洞、盒子、球、积木、秋千等。同时考虑到大鼠的昼夜习性、摄食习惯等因素，每周更换二至三次环境布置。 新生大鼠大脑具有丰富的神经干细胞和神经前体细胞，理论上具有很大的神经可塑性。但是，新生大鼠的神经干细胞和前体细胞对于缺氧缺血损伤极为敏感，容易受到损害。因此，丰富环境是否可以改善HIBD大鼠神经行为预后，是否可以促进干细胞的增殖分化值得探究。此外，丰富环境干预脑损伤成年大鼠的窗口期是损伤后一周，但术后一月内干预仍有效果。鉴于新生大鼠神经可塑性更强，理应有更长的干预窗口期。本实验希望了解在不同的起始时间予以不同强度的丰富环境干预对于HIBD大鼠神经预后、齿状回神经干细胞增殖和分化、髓鞘形成以及海马神经营养因子含量的影响，以了解丰富环境干预对于HIBD大鼠的神经行为学影响以及可能的作用机理。 第一部分丰富环境对于缺氧缺血新生大鼠的神经行为能力的影响 目的：了解不同起始时间和强度的丰富环境干预对于HIBD新生大鼠神经行为学预后的影响。方法：7日龄新生大鼠结扎右侧颈总动脉，在含8％氧气的缺氧箱中缺氧2小时，造成新生大鼠HIBD模型。大鼠分为早期干预组、中期干预组和晚期干预组，分别在HIBD术后第7、14和21天，即生后第14、21和28天开始丰富环境干预，干预期为14天，以了解不同干预起始时间对于干预效果的影响。早中期干预组又分为每天干预1小时、6小时和24小时组，以了解不同干预强度对于干预效果的影响。早中期干预结束后于缺氧缺血(HI)造模后第29天行悬吊试验；HI后第29～32天行水迷宫试验。晚期干预组丰富环境干预结束后于HI后第36天行悬吊试验；第36～39天行水迷宫试验。结果：早中期组每天干预1小时，大鼠的悬吊试验得分(2.86±1.23分和2.74±0.97分)与缺氧缺血组(2.35±1.02分)相比无显著提高；水迷宫试验成绩(分别为53.28±21.23和51.23±22.43s)与缺氧缺血对照组(56.66±10.96)相比无显著提高。而早期干预6、24小时组、中期干预6、24小时组及晚期干预24小时组的悬吊试验成绩(分别为3.67±1.12、3.50±1.41、3.50±0.93、3.56±1.13、3.50±0.92分)和早期干预6小时组、中期干预6、24小时组及晚期干预24小时组的水迷宫试验(46.49±19.27、38.20±18.36、47.96±20.65、35.93±22.45秒)成绩显著高于相应时段的缺氧缺血对照组，但是早中期6小时、24小时干预组之间的悬吊试验成绩和水迷宫试验成绩没有显著性差异。结论：一定强度的丰富环境干预可以显著改善HIBD大鼠的前肢运动能力和空间记忆能力；而且年幼的HIBD大鼠可能具有比较长的干预窗口期。 第二部分丰富环境对于HIBD新生大鼠齿状回神经再生和脑髓鞘形成的影响 目的：了解丰富环境干预对于大体病理改变、齿状回神经再生和脑髓鞘形成的影响。方法：本部分大鼠HIBD造模和丰富环境干预方法同第一部分。大鼠分为早期干预组、中期干预组和晚期干预组，分别在HIBD造模后第7、14和21天开始丰富环境干预，干预14天。早中期干预组又分为每天干预6小时和24小时组，晚期干预组每天干预24小时。大鼠在丰富环境干预的同时，每天腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶(BrdU)50mg／kg，共14天；假手术组和缺氧缺血对照组大鼠也在相对应的时间注射BrdU。早中期组在HI后第32天处死；晚期干预组在HI后第39天处死。取海马齿状回互包平面进行病理及免疫组化检测。测量大鼠损伤侧脑横径和半脑面积，了解丰富环境对大脑病理学的影响。通过BrdU和神经巢蛋白(nestin)的荧光免疫双标检测齿状回新生的神经干细胞；BrdU和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫双标检测新生的星形胶质细胞；BrdU和微管相关蛋白2(MAP2)的荧光免疫双标检测新生的神经元，了解丰富环境干预对于海马齿状回神经干细胞再生和分化的影响。标记脑组织的髓鞘碱性蛋白(MBP)，了解HIBD和丰富环境干预对于髓鞘的影响。结果：HIBD大鼠和各丰富环境干预组大鼠损伤侧脑横径和半脑面积无统计学差异。荧光免疫双标结果显示：早、中、晚期缺氧缺血组的海马齿状回的新生细胞总和(分别为102.23±24.44、100.67±31.45、72.45±26.38个)显著高于同期假手术组(分别为22.34±5.71、25.45±6.78、27.45±4.57)；早、中、晚期缺氧缺血组的海马齿状回新生神经元细胞(分别为37.25±20.06、44.57±13.95、28.67±14.57)显著高于同期假手术组(分别为6.17±2.71、10.17±2.64、10.50±2.89)。早期6小时、24小时干预组、中期6小时、24小时干预组和晚期干预24小时组的海马齿状回的新生细胞总和(分别为142.56±21.56、152.57±29.67、157.05±25.78、162.79±29.92、115.34±25.79个)显著高于同期缺氧缺血组。早期6小时、24小时干预组、中期6小时、24小时干预组和晚期干预24小时组的海马齿状回的新生神经元细胞数量(分别为99.85±27.43、94.00±26.97、99.75±20.49、114.85±24.74、72.00±24.91个)显著高于同期缺氧缺血组，显示了丰富环境可以促进齿状回以神经元为主的神经再生。各组间齿状回的新生神经干细胞和星形胶质细胞的数量差异不明显。MBP标记脑白质髓鞘的结果显示：早中期和晚期缺氧缺血对照组MBP阳性细胞比例(分别为6.32±1.63％和6.74±2.19％)显著少于同期假手术组(9.09±1.69和9.37±2.46％)，各期丰富环境干预组MBP阳性细胞比例虽然与假手术组相比有所升高，尤其是中期干预组6小时组(8.89±2.29)和中期干预24小时组(8.48±2.67)，但与假手术组相比尚未达到统计学差异。结论：丰富环境干预对于脑宏观病理改变无显著影响；丰富环境干预增加海马齿状回新生细胞形成，尤其是新生神经元的形成；缺氧缺血可损伤大脑髓鞘的形成，丰富环境干预对于缺氧缺血后髓鞘的形成可能有有益影响。 第三部分丰富环境对于HIBD大鼠海马NGF、BDNF的影响 目的：了解丰富环境干预对于HIBD大鼠海马神经生长因子(nerve growthfactor，NGF)和脑源性神经生长因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)含量的影响。方法：本部分大鼠分组、HIBD造模和丰富环境干预同第二部分。早中期组在HI后第29天处死，晚期干预组在HI后第36天处死，取海马部分以Western blot的方法检测NGF—β和BDNF含量。结果：早中期和晚期HIBD对照组海马的NGF—β相对丰度(分别为0.4939±0.1837、0.3500±0.1095)显著高于同期假手术组(分别为0.1433±0.0536、0.1003±0.0777)：早中期和晚期HIBD对照组海马的BDNF含量(分别为0.9352±0.1961和0.4274±0.1764)显著高于同期假手术组(分别为0.1758±0.1058和0.1086±0.0688)，而早期6小时、24小时干预组、中期6小时、24小时干预组和晚期干预组海马NGF—β的相对丰度(分别为1.0419±0.1972、1.1849±0.3396、1.2250±0.4331、1.4587±0.5351、0.7799±0.2533)显著高于同期缺氧缺血组。早期6小时、24小时干预组、中期6小时、24小时干预组和晚期干预组的海马BDNF含量(分别为1.9112±0.4088、1.7472±0.2484、1.6027±0.6925、1.8560±0.4891、1.0565±0.4415)显著高于同期缺氧缺血组。结论：缺氧缺血损伤显著增加海马NGF和BDNF含量，而丰富环境干预进一步增加HIBD后海马NGF和BDNF丰度。 通过实验，我们得出以下结论： 1．丰富环境干预可以显著改善HIBD大鼠的神经行为预后，无论是在缺氧缺血后的早期、中期还是晚期开始干预均有效果，显示了年幼大鼠可能具有比较长的干预窗口期。 2．每天干预6小时与干预24小时的效果明显优于每天干预1小时。但是每天干预6小时组与24小时组之间没有显著性差异，提示对于本模型的新生大鼠，每天干预6小时的强度即已足够，再增加干预强度也不能进一步改善HIBD大鼠的神经学预后。 3．无论是早期、中期还是晚期干预组，丰富环境干预均显著增加HIBD新生大鼠齿状回的神经再生，在新生细胞中，神经元占大多数。丰富环境干预可增加脑髓鞘的形成。 4．早中晚期丰富环境干预均可以显著增加HIBD大鼠海马的NGF和BDNF的含量。 5．丰富环境促进齿状回神经再生并增加海马NGF和BDNF的含量，这可能是丰富环境改善HIBD大鼠神经行为预后的机理之一。