Pectate lyase基因的克隆分析及其表达载体的构建

果胶酶(Pectinase)是一类能够降解果胶物质的多种组分的复合酶类,广泛存在于高等植物和微生物中,通常动物细胞不能合成这类酶。它包括原果胶酶、果胶酯类、果胶水解酶和果胶裂解酶(Pectate lyase)。 果胶酶是世界五大商品酶之一,近些年在纺织行业上的棉麻脱胶应用方面效果显著,使产品质量有所提高,同时降低或不用化学品在棉麻脱胶工艺的应用,减少了对环境的污染等。此外,果胶酶在食品加工、饲料加工、造纸、诱导植物抗病、提高木材防腐作用、治疗胃石及单细胞食品制备等方面都有重大的应用价值。目前作为工业应用的果胶酶都是从微生物中得到的。据报道,已有四十多种微生物能产生果胶酶,研究和应用较多的是霉菌果胶酶,它的酶系较完全。 果胶酶的研究应用已久,国外的研究学者在微生物果胶酶分子生物学方面做了很多的工作,但国内的研究者主要从事菌种的筛选、诱变和条件的优化等工作,对分子生物学方面的研究较少。随着生物技术的发展,利用基因工程技术进行菌种选育,使菌种的产酶量有较大的提高,而且能够改变酶的性质,使多种有利特性集中到一株菌种上,缩短从探索研究到应用的时间,克服了传统育种方法的盲目性。 本研究根据GenBank中提交的果胶裂解酶基因序列进行比对,用Primer5.0从比对结果中设计了果胶裂解酶基因保守区域的一对引物,以本实验室筛选的具有降解果胶质功能的一株细菌的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得长877bp目的片段。经Blastx分析结果表明:该目的基因片段与来源于Erwinia chrysanthemi中克隆的Pectate lyase(pelC)基因(登录号:AJ132325)碱基同源性最高,达到94%。 再根据所获得的pelC基因保守区域序列来分别向3’端和5’端各自设计三个嵌套引物和已登录的不同的Pectate lyase基因序列设计简并引物,采用TAIL-PCR技术扩增Pectate lyase(pelC)基因保守区域两端的未知侧翼序列,经序列测定后,拼接得到长为1385bp的目的序列。 经分析,该拼接序列含有一个完整的编码框1125bp,包含启始密码子ATG和终止密码子TAA。根据分析结果在该序列两端设计了一对特异引物对完整目的序列进行扩增,测序结果与拼接结果完全一致。经predictprotein在线分析预测,该基因编码374个氨基酸,所编码的蛋白属于α-β类型,可能含有4个α螺旋和27个β折叠。该基因