通过调节JAK2-STAT3和Wnt5a信号通路可能是缺血后处理及低温减轻全脑缺血性脑损伤的分子机制

先天性心脏病目前已经成为我国首位出生缺陷性疾病，先心病外科手术一直占中国大陆心脏外科手术的55-60%，是我国首位的心脏外科治疗的病种。虽然婴幼儿体外循环技术逐步完善提高，但是体外循环本质就是一个控制性缺血缺氧的过程，特别是在部分婴幼儿主动脉弓部手术，不可避免存在深低温、停循环、全脑缺血的过程，此时患者大脑将面临缺血-再灌注损伤及后续的潜在损伤。 全脑缺血脑损伤本质主要是由于缺血、缺氧导致脑组织氧及能量代谢紊乱，并最终引起脑组织损伤。在全脑缺血的状态下，脑细胞的氧及能量的供给减少，无氧代谢增加，高能磷酸化合物的储备耗尽，同时继发一系列病理过程，如：兴奋性氨基酸（EAA）的细胞毒性激活、神经细胞内钙离子(Ca2+)超载、特定神经元细胞内氧自由基的过度形成、“瀑布式”自由基连锁反应、炎性细胞因子产生、游离脂肪酸的聚集、内环境紊乱等多个环节，如不加予干预，这些过程最终将导致脑细胞功能受损，进而分裂、死亡。近年来，大量研究证实，缺血后的器官组织血流恢复后在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍，这种恢复血流灌注后引起的进一步损害称为缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury）。缺血/再灌注损伤机制十分复杂，其中涉及到内源性物质的触发和释放、细胞内及线粒体内钙超载、再灌注时氧自由基的爆发、中性粒细胞活化等诸多因素，相互间构成一个负反馈的网络，导致缺血器官组织血流恢复后进一步损伤。 如何来减轻器官组织缺血/再灌注损伤，多年来大量研究试图通过找到有效的干预措施或药物治疗来实现，虽然发现有些药物或处理措施在实验动物身上有效，但到目前为止能成功应用于临床的仍然很少。 2003年Zhao等发现心肌缺血后再灌注前进行反复、短暂的心肌缺血再灌注能保护心肌对抗随后的再灌注损伤，从而提出了缺血后处理的概念。缺血后处理是通过激发机体内在的保护机制，研究表明其中的机制可能包括保护性内源性物质的触发和释放，氧自由基的释放减少，以及与细胞内的部分信号通路激活有关等。因缺血后处理能在缺血后实施，具有较强的可控性，临床操作简便易行，其潜在的临床应用可能更直接有效的。 目前国内外已经有大量的试验证实低温对全脑缺血的脑保护作用。低温的脑保护作用不仅局限在减少能量代谢和氧耗，还具有抑制兴奋性氨基酸释放、抑制氧自由基的过度形成和细胞内钙离子(Ca2+)超载，明显增加脑组织对缺血的耐受性。临床心脏外科手术体外循环中已经成功地将不同程度的低温应用于术中脑保护，特别是深低温停循环技术应用于部分婴幼儿主动脉弓部手术。 JAK（Janus kinase）-STAT（signal transducer and activator oftranscription）是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径。JAKs蛋白家族迄今为止共发现JAK1、JAK2、JAK3、TYK2四个成员，STATs蛋白家族目前已克隆出STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6这7个哺乳动物的STAT家族成员。目前研究证实该通路广泛参与细胞的增殖、分化、应激、凋亡以及炎症反应和免疫调节等过程。关于JAK-STAT途径的研究大多集中在肿瘤、肝脏疾病、神经细胞的生成、造血系统疾病和心脏病中研究较多。有文献报道JAK-STAT信号转导途径参与缺血性脑损伤。有研究表明亚低温可降低JAK1和STAT1的表达，抑制缺血缺氧后JAK1-STAT1通路的促凋亡作用，进而影响了STAT1下游靶基因的转录，表现为抑制促凋亡基因Caspase-3，BAX等的表达，增加抗凋亡因子Bc1-2、Bcl-x1等的表达，从而减轻缺血再灌注脑损伤。有研究证实了JAK2-STAT3通路介导缺血后处理的心肌保护作用。 Wnt基因编码的Wnt蛋白家族属于分泌型糖蛋白，它们通过旁分泌或自分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活胞内的各级信号传导分子，调节靶基因的表达。Wnt/Ca2+通路主要由wnt5a和wntll激活，可能通过G蛋白激活PLC（Phospholipase C）和PKC（Proteinkinase C），从而引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca2+敏感信号成分的激活。近年来，该通路其在炎症及凋亡中的作用逐渐引起人们的关注。 基于以上的理论及研究结果，考虑到婴幼儿主动脉弓部手术，存在低温、全脑缺血的过程，我们设计了该课题，以期探讨JAK2-STAT3通路和Wnt5a非经典信号通路是否参与低温和缺血后处理介导脑保护的分子机制，进一步指导临床应用。本课题分为以下几个部分： 第一部分：探讨减轻全脑缺血性脑损伤的最佳缺血后处理方案 目的：探讨减轻全脑缺血性脑损伤的最佳缺血后处理方案 方法：以成年雄性SD大鼠为研究对象，以四血管阻塞法，夹闭双侧颈总动脉20分钟，建立大鼠全脑缺血模型为基本方法。开放双侧颈总动脉再灌注前分别采取多种短暂性脑缺血后处理方案，后处理方案包括7组：缺血再灌注组、15秒×1次（15×1）组、15秒×3次（15×3）组、30秒×1次（30×1）组、30秒×3次（30×3）组、60秒×1次（60×1）组，空白组，每组8只SD大鼠。48h后，检测大鼠神经功能损伤评分后，处死，行前脑切片HE染色和TUNEL染色，Western blot法检测脑组织bcl-2、caspase-3的表达量，观察不同缺血后处理方案对全脑缺血后再灌注脑组织的损伤情况。 结果：缺血再灌注组大鼠脑额顶叶皮质及相应的皮质下结构可见明显神经元损伤，而且损伤程度最严重。与缺血再灌注组比较，五种缺血后处理方案均能减轻大全脑缺血再灌注所致的脑损伤，但减轻程度不一样，其中，缺血后处理15x3组效果最明显。 结论：实验结果显示，短暂性脑缺血后处理对大鼠全脑脑缺血具有神经保护作用。其中，缺血后处理15秒x3次方案可能是本实验设计方案中的最佳方案。 第二部分：缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。 目的：（1）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道在大鼠全脑脑缺血后的不同时间的表达。 （2）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道在缺血后处理及深低温条件下减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤中的作用。 方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，检测大鼠神经功能损伤评分，免疫组织化学法和western blot法分别检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a，β-catenin的表达。 （2）另外再设计7组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后检测大鼠神经功能损伤评分，同时通过western blot法检测脑组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a、的表达的蛋白表达水平。 结果：大鼠全脑脑缺血再灌注后，p-JAK2、p-STAT3、Wnt5a在大脑皮质的表达24h达到高峰，JAK2、STAT3缺血24h表达最少，β-catenin表达变化不明显。缺血后处理及低温均可减轻全脑脑缺血再灌注脑损伤，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。 结论：JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道在全脑脑缺血再灌注后早期被激活，24小时达到高峰。此外，缺血后处理及低温可能通过调节JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤。 第三部分：通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症反应可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一。 目的：（1）探讨大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤后炎症反应以及炎症介质不同时间的表达水平。 （2）进一步探讨是否通过JAK-STAT和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症反应，从而减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。 方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，分别检测髓过氧物酶（MPO）的表达含量，以免疫组织化学法和western blot法进一步检测缺血脑组织促炎症因子TLR2、TLR4、NF-κB和COX-2的表达水平，用ELISA法检测大鼠血清TNF-α的含量。 （2）另外再设计8组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、空白对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温组+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后，分别检测各组检测髓过氧物酶（MPO）的表达含量，大脑组织TNF-α的分泌情况，通过western blot法检测脑组织促炎症因子COX-2、NF-κB的表达水平。 结果：炎症标志物MPO含量从脑缺血后24h达到高峰，维持至48h，到72小时逐渐下降，但仍高于正常水平。TLR2、TLR4、COX-2、NF-κB和TNF-α的表达也于脑缺血后24h达到高峰。缺血后处理及低温可降低全脑脑缺血再灌注脑损伤后的炎症反应以及促炎症因子的表达水平，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。 结论：大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤诱导炎症反应和促炎症因子的表达，24小时达到高峰。此外，缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症介质的表达和炎症反应，这可能是减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤的机制之一。 第四部分：通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制神经元凋亡可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一。 目的：（1）探讨大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤后不同时间点神经元凋亡的水平。 （2）进一步探讨是否通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制神经元凋亡，从而减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。 方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，以Tunel染色法和western blot法进一步检测缺血脑组织bcl-2/BAX，caspase-3的表达水平。 （2）另外再设计8组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、空白对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温组+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后，通过大脑HE染色及Tunel染色了解脑细胞凋亡情况，western blot法进一步检测缺血脑组织bcl-2/BAX，caspase-3的表达水平。 结果：全脑脑缺血再灌注脑损伤后缺血脑组织发生神经元凋亡，凋亡从脑缺血后开始，24h达到高峰，高峰期维持到48-72h，随后降低，但仍高于正常水平。缺血后处理及低温可降低全脑脑缺血再灌注脑损伤后的BAX、caspase-3的表达水平，升高bcl-2的表达水平，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。 结论：大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤诱导缺血脑组织神经元凋亡，BAX、caspase-3的表达水平的激活。此外，缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制BAX、caspase-3的激活及脑细胞的凋亡，这可能是减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤的机制之一。