PI3K/AKT-eNOS介导淫羊藿苷促进骨髓基质细胞和成骨细胞的成骨性分化研究

目前我国人口结构老龄化程度开始加重，骨质疏松症的发病率也随之增长，已成为严重影响中老年健康的多发和常见疾病之一。中草药淫羊藿（Epimedium grandiflorumMorr）具有补肾助阳、强筋健骨和祛风除湿的功能。其中，淫羊藿苷（Icariin, ICA）是淫羊藿中含量最为丰富的黄酮苷类化合物，具有显著的抗骨质疏松活性，但其作用机理尚不清楚。 本实验对大鼠骨髓基质细胞（rBMSCs）和大鼠成骨细胞（OB）进行了研究，分别通过贴壁分离法和酶消化法分离获得细胞并加以鉴定，待细胞铺满皿底后分为ICA组（1×10-5mol·L-1）、LY294002组（5×10-5mol·L-1）、ICA+LY294002组和空白对照组。不同药物处理24h后分别利用Real-time PCR法检测ALP、eNOS和iNOS的基因表达水平，用Western blot法检测p-AKT、eNOS和iNOS蛋白表达量，同时测定总一氧化氮合酶（TNOS）活性、iNOS活性和NO生成量，对淫羊藿苷促进rBMSCs、OB成骨性分化的信号机理进行研究，以阐明淫羊藿苷的抗骨质疏松机制，以及为开发和应用新型抗骨质疏松药物提供科学依据和理论基础，并得到了以下结果： 1、10-5mol·L-1ICA极显著的提高了rBMSCs的ALP基因表达和蛋白质表达水平（P<0.01）。淫羊藿苷使rBMSCs的ALP和p-AKT表达水平显著升高，而LY294002可使其均显著下降，说明LY294002可以抑制由淫羊藿苷引起的骨髓基质细胞的成骨性分化，PI3K的下游靶标是AKT，即淫羊藿苷通过激活PI3K/AKT途径来促进rBMSCs的成骨性分化。 2、PI3K/AKT通过eNOS促进rBMSCs的成骨性分化：淫羊藿苷提高rBMSCs的eNOS和iNOS的表达量，但LY294002仅能抑制eNOS的表达，对iNOS则无明显影响，说明PI3K/AKT与eNOS存在上下游关系，最终确定淫羊藿苷通过AKT-eNOS途径促进rBMSCs成骨性分化。 3、淫羊藿苷通过PI3K/AKT－eNOS信号途径促进rBMSCs的成骨性分化：淫羊藿苷能够提高rBMSCs的TNOS活性、iNOS活性和NO生成量，LY294002抑制TNOS活性和NO生成量，但对iNOS活性无影响，表明TNOS活性和NO生成量的变化与eNOS相一致，说明NO的生成主要受eNOS的影响，即淫羊藿苷通过PI3K/AKT－eNOS途径促进rBMSCs的成骨性分化。 4、淫羊藿苷对成骨细胞的相关基因与蛋白检测结果与rBMSCs趋势一致，说明淫羊藿苷促进OB的成骨性分化过程也由PI3K/AKT－eNOS信号途径发挥作用。 总之，淫羊藿苷通过PI3K/AKT－eNOS途径促进rBMSCs和OB的成骨性分化。