淫羊藿苷通过调节卵巢颗粒细胞增殖与分泌功能改善DOR患者IVF助孕结局的临床与机制研究

目的:临床方面探讨影响DOR肾阳虚证患者IVF助孕妊娠结局的因素和有效的临床干预措施;基础研究从细胞及分子通路方面阐明淫羊藿苷调节卵巢颗粒细胞增殖与分泌功能改善卵巢功能的生物学作用机制。方法:临床研究部分选择接受IVF-ET治疗的DOR肾阳虚证患者作为研究对象,设卵巢储备功能正常患者为对照组;卵巢储备功能正常患者采用常规短效长方案促排卵,DOR肾阳虚证患者采用微刺激方案促排卵;观察指标包括患者一般情况、卵巢储备功能指标、IVF治疗周期中关键指标、卵母细胞质量指标、卵母细胞发育潜能指标:分析影响DOR肾阳虚证患者IVF助孕临床结局的因素。DOR肾阳虚证患者随机分为温肾补阳治疗组和对照组,治疗组患者自进入IVF促排治疗周期前一个月的经期开始口服复方玄驹胶囊,一次3粒,一日3次,服用至取卵扳机日,其余促排卵方案和IVF相关治疗同前;观察上述指标和治疗前后DOR肾阳虚证患者的中医证候评分的变化。基础研究部分,对人类颗粒细胞样肿瘤细胞(KGNcells)进行培养,加入药物处理细胞并分为6组:①对照组(PBS处理);②ICA处理组(5ug/L);③ICA处理组(10ug/L);④ICA处理组(25ug/L):⑤ICA处理组(50ug/L);⑥ICA处理组(75ug/L);检测颗粒细胞增殖能力、雌激素、孕激素分泌以及CREB蛋白表达水平,阐明ICA影响颗粒细胞增殖以及类固醇激素分泌的分子机制。结果:1)DOR肾阳虚证患者与卵巢储备功能正常患者比较,年龄显著增大,卵巢储备功能的评估指标(bFSH、AMH水平和AFC值)以及IVF治疗中的关键指标,获卵数、MⅡ卵数、正常受精率、卵裂率、和优质囊胚率方均有显著性降低。提示DOR肾阳虚证患者获得MⅡ卵数量显著降低,而在MⅡ卵数具有显著统计学差异的前提下,进行体外受精胚胎培养后,结果显示D3优质胚胎率两者无统计学差异,优质囊胚率两者有显著统计学差异,进一步提示DOR肾阳虚证患者卵母细胞的发育潜能尤其发育到优质囊胚的潜能显著下降。2)DOR肾阳虚证患者经过温肾补阳治疗后,肾阳虚证中医证候得到有效改善,治疗前评分为21.71±2.07,治疗后评分为18.06±2.15,有显著统计学差异;肾阳虚证得到改善后,D3优质胚胎率和囊胚形成率得到明显提高。3)淫羊藿苷可调节颗粒细胞雌二醇的分泌水平和增殖能力,淫羊藿苷浓度为5ug/L,能够显著上调颗粒细胞雌二醇的分泌水平和增殖能力,对其孕酮分泌影响不大;进一步对颗粒细胞的CREB蛋白表达进行分析,发现淫羊蕾苷浓度为5ug/L时显著上调颗粒细胞CREB蛋白的表达。结论:1)DOR肾阳虚证患者年龄显著升高,获得MⅡ卵数量显著降低,优质囊胚率显著下降,提示DOR肾阳虚证患者卵母细胞的发育潜能尤其发育到优质囊胚的潜能显著下降。对其早期评估,有效干预,临床意义重大。2)温肾补阳治疗可显著改善DOR肾阳虚证患者中医证候评分,在IVF治疗中显著提高D3优质胚胎率和囊胚形成率,为改善临床妊娠结局提供有力保障。3)淫羊藿苷可显著提高颗粒细胞雌二醇的分泌,显著上调颗粒细胞的增殖水平;淫羊藿苷浓度为5ug/L时,改善颗粒细胞的增殖能力和类固醇激素分泌作用最为显著,研究表明淫羊藿苷从颗粒细胞增殖和类固醇激素分泌两方面对颗粒细胞功能进行调节。4)淫羊藿苷可显著上调颗粒细胞CREB蛋白表达水平,推断淫羊藿苷通过上调颗粒细胞芳香化酶基因转录分子通路而调节卵巢颗粒细胞功能的生物学作用机制。